Ten protokół jest fragmentem Sunderhausa i Kretzschmara, Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. Mocowanie głowy na kołnierzach i zatapianie w parafinie
UWAGA: Wszystkie etapy procesu utrwalania powinny być wykonywane w dygestorium. Benzoesan metylu, choć nie stanowi zagrożenia dla zdrowia, ma bardzo wyraźny zapach, który może być przytłaczający, jeśli nie jest obsługiwany pod wyciągiem.
- Przed znieczuleniem muszek należy uzupełnić 50 ml roztworu Carnoya, dodając 15 ml chloroformu i 5 ml lodowatego kwasu octowego do 30 ml 99% etanolu (nie mieszać chloroformu i kwasu octowego). Wlej go do szklanego pojemnika z płaskim dnem, takiego jak naczynie krystalizujące, aby upewnić się, że kołnierze mogą leżeć płasko i są całkowicie pokryte roztworem.
- Znieczulić muchy CO2 lub eterem.
- Nawlecz muchy (do 20 w przypadku większości obroży) za szyję do obroży za pomocą kleszczy. Pamiętaj, aby ustawić wszystkie głowy w tej samej orientacji, jak pokazano na Rysunek 1A, i bądź delikatny, aby upewnić się, że nie dojdzie do uszkodzenia głowy lub oczu.
- Uwzględnij muchy sinusoidalne (strzałki, Rysunek 1A) w losowych pozycjach, aby kolejność much można było łatwo zidentyfikować w sekcjach. Ponadto, jeśli eksperymentalne muchy mają jasny lub biały kolor oczu, nawlecz między nimi kilka much o czerwonych oczach, takich jak dzikie, aby upewnić się, że obecna jest wystarczająca ilość pigmentu do zabarwienia szkiełka. Zapisz kolejność much na karcie protokołu wraz z numerem obroży, jeśli używasz więcej niż jednej obroży.
- Po wykonaniu obroży umieść ją w przygotowanym roztworze Carnoya na 3,5 - 4 godziny.
- Wylej roztwór Carnoya do odpowiedniego kanistra do utylizacji i rozpocznij płukanie etanolem. Upewnij się, że nalewasz powoli, aby nie przeszkadzać w umieszczeniu kołnierzy w pojemniku.
- Pierz obroże przez 30 minut w 99% etanolu dwukrotnie.
- Pierz obroże w 100% etanolu przez 1 godzinę. Pamiętaj, aby zmienić pranie na czas, aby zapobiec nadmiernemu odwodnieniu.
- Umieścić kołnierze w benzoesanie metylu O/N w temperaturze pokojowej. Uszczelnić pojemnik parafilmem, aby zapobiec parowaniu benzoesanu metylu.
- Wlać metylobenozian do odpowiedniego pojemnika jednorazowego użytku w dygestorium. Dodać wcześniej przygotowaną mieszaninę wosku parafinowego o niskiej temperaturze topnienia (56 - 57 °C) w stosunku 1:1 i benzoesanu metylu. Od tego momentu obroże muszą być przechowywane w inkubatorze w temperaturze 65 °C, aby mieć pewność, że parafina nie stwardnieje.
- Wylać mieszaninę metylobenzozynianu i parafiny do odpowiedniego pojemnika jednorazowego użytku, a następnie wlać stopiony czysty wosk parafinowy, przechowywany w temperaturze 65 °C, na kołnierze.
- Zmień parafinę po 30 minutach i powtórz to co najmniej 5 razy. Należy wykonać co najmniej 6 - 8 prań.
- Po zakończeniu prania umieść obroże w gumowej tacce na kostki lodu z otworami mniej więcej wielkości obroży. Wlej na nie stopioną parafinę, aż do całkowitego przykrycia i pozwól jej stwardnieć (staraj się unikać pęcherzyków powietrza).
- Wyjmij bloki parafiny zawierające kołnierze z tacki na kostki lodu. Oddziel blok parafiny od obroży za pomocą żyletki, delikatnie odrywając kołnierz. Głowy będą znajdować się w bloku parafinowym, podczas gdy ciała pozostaną w kołnierzu. Bloki można przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Aby wyczyścić obroże, namocz je w środku do deparafinizacji w temperaturze 65 °C w celu usunięcia parafiny, wyczyść lekkim szorowaniem i umyj w etanolu przed ponownym użyciem.
