Ten protokół jest fragmentem artykułu Nazario-Toole i Wu, Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay, J. Vis. Exp. (2019).
1. Przygotuj cząsteczki fluoresceiny do wstrzyknięcia
- Rozpuść 10 mg dostępnych w handlu, zabitych termicznie cząstek bakterii znakowanych fluoresceiną (patrz tabela materiałów) do stężenia podstawowego 10 mg/ml, dodając 990 μl sterylnego 1x PBS i 10 μl 50 mM azydku sodu. Wirować do mieszania.
- Podzielić na jednorazowe porcje 8 μl w probówkach o pojemności 0,2 ml i przechowywać w ciemnym pudełku w temperaturze 4 °C, aby zminimalizować wrażliwość związaną ze światłem.
UWAGA: Środek konserwujący azydek sodu jest opcjonalny i można go pominąć, jeśli zapasy 10 mg/ml są wykonane z 1 ml sterylnego 1x PBS, podzielonego na porcje i przechowywanego w temperaturze -20 °C.
- Przygotować 10 ml roztworu 5% barwnika spożywczego w 1x PBS, mieszając 500 μl strzykawki przefiltrowanego zielonego barwnika spożywczego i 9,5 ml sterylnego 1x PBS.
- Umyj cząstki przed wstrzyknięciem w celu usunięcia azydku sodu. Wymieszaj 42 μl sterylnego 1x PBS i 8 μl 10 mg/ml w probówce o pojemności 1,7 ml. Wirować z maksymalną prędkością przez 2,5 minuty w temperaturze pokojowej.
- Usunąć sklarowany osad, dodać 50 μl 1x PBS i odwirować z maksymalną prędkością przez 2,5 minuty w temperaturze pokojowej.
- Powtórz kroki 1.3 i 1.3.1 2x, co daje w sumie 3 prania.
- Po ostatnim praniu wyrzuć supernatant i ponownie zawiesij cząstki do 1,6 mg/ml w 50 μl 5% barwnika spożywczego w 1x PBS.
- Owiń rurkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem. Przechowywać w temperaturze 4 °C, wyrzucić po 1 tygodniu.
2. Przygotuj stację wtryskową i muchy
- Przygotować podkładkę do wstrzykiwań. Aby wstrzyknąć do 4 genotypów much w tym samym czasie, użyj taśmy laboratoryjnej, aby podzielić prostokątną podkładkę na muchy CO2 na 4 sekcje. Na stole w pobliżu mikroskopu wyznacz obszary, w których należy umieścić fiolki po ułożeniu much na podkładce (po jednej na każdy róg podkładki).
- Przygotuj fiolki z dopasowanymi do wieku, 4-7 dniowymi muchami do wstrzykiwań. Dla każdego szczepu, który ma być poddany testowi, przenieś 5 samców i 5 samic do świeżej, oznakowanej fiolki z przygotowanym pokarmem dla much i utrzymuj w temperaturze 25 °C.
- Przygotuj wtryskiwacz pneumatyczny (patrz Tabela materiałów), ustawiając przyrząd na tryb TIMED 100 ms (krótkie impulsy ciśnienia gazu w celu wydalenia cieczy – umożliwiające dostarczanie objętości sub-nanolitrów).
- Przygotuj szkiełka mikroskopowe. Wytnij 1,5-calowe paski taśmy izolacyjnej, złóż w pętlę stroną samoprzylepną na zewnątrz i umieść na oznaczonym szkiełku mikroskopowym.
3. Przygotuj szklane igły kapilarne
- Wyciągnij szklane igły (cienkościenne szklane kapilary) za pomocą ściągacza do igieł.
- Przytrzymaj igłę pod mikroskopem z mikrometrem i złamij końcówkę za pomocą pęsety ze stali nierdzewnej #5 z drobnym czubkiem. Końcówki 100 μm wystarczą, aby przebić naskórek muchy, jednocześnie minimalizując zranienia.
- Zmierz objętość płynu, który zostanie wstrzyknięty do każdej muchy. Załaduj igłę sterylnym 5% barwnikiem spożywczym do 1x PBS i wylej płyn na kroplę oleju mineralnego na mikrometrze 0,01 mm stage.
UWAGA: Jeśli kropla cieczy jest kulista, objętość w pikolitrach oblicza się jako (rozmiar)3/1910. Igła o średnicy 100 μm wyrzuci ~2 nL w ciągu 100 ms.
4. Wstrzykiwanie much
- Odpipetować 10 μl cząstek o stężeniu 1,6 mg/ml na mały kwadrat parafilmu.
- Wciągnąć płyn do igły i zamontować w dyszy wtryskiwacza (patrz Tabela materiałów).
- Znieczulij muchy CO2 i ustaw je w wyznaczonym miejscu na flypad, brzuszną stroną do góry i głowami skierowanymi do przodu podkładki. Umieść fiolki w odpowiednich miejscach na ławce.
- Wstrzyknąć muchy w górny róg brzucha za pomocą 5, 100 ms pompek płynu (łącznie ~10 nL).
- Przenieść wstrzyknięte muchy do odpowiednich fiolek, zanotować godzinę na fiolce. Przechowywać w temperaturze 25 °C.
- Załadować nową igłę 0,4% roztworem błękitu trypanowego.
- Ustaw wtryskiwacz pneumatyczny w pozycji GATED, która umożliwia stały przepływ powietrza w celu wypchnięcia płynu z igły.
- Znieczulenie muszek po 30 minutach odpoczynku należy i wstrzyknąć Trypan Blue, aż brzuch będzie pełny i rozdęty.
UWAGA: Podczas badania dojrzewania fagosomu z cząstkami znakowanymi barwnikiem wrażliwym na pH, pozwól muszkom odpocząć przez 1 godzinę i nie wstrzykiwaj błękitu trypanowego przed zamontowaniem much.
- Montaż muchy na szkiełkach mikroskopowych za pomocą taśmy izolacyjnej, brzuszną stroną do dołu. Popchnij skrzydła na bok rozporka i przymocuj je do taśmy. Delikatnie wepchnij głowę w taśmę, aby upewnić się, że mucha się nie poruszy.
