$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem Bantel and Tessier, Taste Preference Assay for Adult Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. Głód
- Przygotuj fiolki na muchy, nasycając wacik wodą o sile 18,2 MΩ na dnie standardowej fiolki na muchy. Alternatywnie, w podobny sposób nasącz mały pasek bibuły filtracyjnej wodą o mocy 18,2 MΩ i umieść pod kątem w fiolce.
- Zbierz muchy w zestawy po ~100 zwierząt na podkładce CO2, a następnie dodaj muchy do przygotowanej fiolki.
UWAGA: Najlepsze wyniki uzyskuje się u zwierząt, które mają mniej niż 5 dni. Jednak dokładny wiek zwierząt może być kontrolowany jako zmienna doświadczalna w celu określenia zmian w preferencjach smakowych w czasie.
- Użyj wacika lub korka piankowego, aby zabezpieczyć fiolki zamknięte. Umieścić fiolki na boku w inkubatorze z kontrolowanym środowiskiem. Utrzymuj temperaturę na poziomie 25 °C, a wilgotność powyżej 70%. Pozostawić fiolki nietknięte przez 24 godziny.
2. Test preferencji smakowych
- Przygotuj wszystkie degustacje do testu tego samego dnia, w którym przeprowadzane jest badanie.
UWAGA: Dokładne degustacje, które należy zastosować, będą się różnić w zależności od zadanego pytania eksperymentalnego. Poniżej znajdują się przykładowe degustacje używane w tym protokole. Zobacz sekcję 4, aby zapoznać się z optymalizacjami.
- Przygotować degustator kontrolny (1 mM sacharozy), łącząc 10 μl 100 mM roztworu sacharozy, 13 μl czerwonego barwnika spożywczego i 977 μl 18,2 MΩ wody.
- Przygotuj eksperymentalny degustator (5 mM sacharozy), łącząc 50 μl 100 mM roztworu sacharozy, 10 μl niebieskiego barwnika spożywczego i 940 μl wody o stężeniu 18,2 MΩ.
- Przygotować komory testowe przy użyciu standardowej plastikowej szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm, przygotowanej w następujący sposób:
- Umieść trzy 10 μl kropli degustacji kontrolnej najbliżej krawędzi płytki na godzinie 12 i kolejne 3 krople na godzinie 6. Upewnij się, że odstępy między kroplami są podobne.
- Umieść trzy krople degustacji eksperymentalnej o objętości 10 μl najbliżej krawędzi płytki na godzinie 3 i kolejne 3 krople na godzinie 9. Upewnij się, że odstępy między kroplami są podobne.
- Powtórz kroki 2.2.1 i 2.2.2 dla dowolnej liczby powtórzeń.
- Opróżnij 1 fiolkę z ~ 100 wygłodzonymi muchami na podkładkę CO2 wystarczająco długo, aby znieczulić wszystkie zwierzęta (około 10 sekund). Wyszczotkuj zwierzęta na środku przygotowanej komory testowej i przykryj pokrywką naczynia.
UWAGA: Należy unikać dłuższych okresów narażenia na CO2 , aby skrócić czas rekonwalescencji i ograniczyć zakłócenia w zachowaniu żywieniowym. Ekspozycja na lód (~5 min) może być wykorzystana do znieczulenia, aby uniknąć skutków behawioralnych CO2 , które mogą wynikać nawet z ograniczonej ekspozycji.
- Umieść komorę testową w nieprzezroczystym pudełku kartonowym. Pamiętaj, aby oznaczyć zewnętrzną stronę pudełka stanem i genotypem, który jest testowany.
- Umieścić cały zestaw (komorę testową znajdującą się w kartonowym pudełku z kroku 2.4) w inkubatorze o temperaturze 25 °C o wilgotności co najmniej 70% na 2 godziny.
- Powtórz kroki od 2.3 do 2.5 dla wszystkich powtórzeń.
- Po 2 godzinach umieścić komory testowe, nadal znajdujące się w kartonach, bezpośrednio w zamrażarce o temperaturze -20 °C, aż będą gotowe do oznaczania ilościowego.
3. Kwantyfikacja testu preferencji smakowych
- Pozwól, aby jedna komora testowa rozgrzała się do temperatury pokojowej (około 5 minut).
- Pod mikroskopem preparacyjnym, za pomocą pędzla lub kleszczy, pogrupuj zwierzęta na podstawie koloru ich brzucha: czerwony, niebieski, fioletowy lub przezroczysty (Ryc. 1).
- Zanotować liczbę zwierząt w każdej grupie. Należy uznać, że zwierzęta nie brały udziału w teście i dlatego nie uwzględnia się ich w żadnych obliczeniach.
- Oblicz indeks preferencji zgodnie z jednym z następujących równań:
- Jeśli do czerwonego barwnika dodaje się eksperymentalny smak, który go interesuje, użyj (Nczerwony + 0,5 Nfioletowy)/(Nczerwony + Nniebieski + Nfioletowy).
- Jeśli eksperymentalny degustant zostanie dodany do niebieskiego barwnika, dostosuj równanie do (Nniebieski + 0,5 Nfioletowy)/(Nniebieski + Nczerwony + Nfioletowy).
- Powtórzyć obliczenia dla wszystkich warunków doświadczalnych i powtórzeń.
4. Optymalizacja testu preferencji smakowych
- Empirycznie określ stężenie wskaźników barwników spożywczych, które mają być stosowane, aby barwienie żywności nie wpływało na wynik testu smaku, w następujący sposób:
- Przygotuj 4 degustatory, używając tego samego związku bazowego (np. 5 mM sacharozy), jak wskazano w kroku 2.1, ale pomiń barwnik spożywczy.
- Dodaj 1,3% czerwonego barwnika spożywczego do jednego z degustatorów. Pozostałe 3 degustacje przygotuj z niebieskim barwnikiem spożywczym o różnych stężeniach w każdej tubce (np. 0,6%, 1% i 1,3%).
- Wykonaj kroki protokołu od 2.2 do 3.4 dla każdej pary degustatorów: 1,3% czerwony vs. 0,6% niebieski; 1,3% czerwony vs. 1% niebieski i 1,3% czerwony vs. 1,3% niebieski.
- Powtórz kroki 4.1.1-4.1.3 z różnymi procentami niebieskiego barwnika spożywczego, aż indeks preferencji uśredni wartość 0 (Rysunek 2).
UWAGA: Na początek 1,3% czerwonego barwnika spożywczego w połączeniu z 1% niebieskiego barwnika spożywczego zazwyczaj daje dobre wyniki. Jeśli nie można dopasować zadowalającego stężenia niebieskiego barwnika spożywczego do 1,3% barwnika, wówczas kroki od 4.1.1 do 4.1.3 można powtórzyć z różnymi stężeniami czerwonego barwnika i stałym stężeniem niebieskiego barwnika spożywczego.
- Przeanalizuj wszystkie warunki, które mają być testowane, z tymi samymi zoptymalizowanymi stężeniami barwników spożywczych.
