Test CApillary FEeder (CAFE): metoda śledzenia spożycia i preferencji żywieniowych u Drosophila

Streszczenie

Źródło: Diegelmann, S., et al. Test CApillary FEeder mierzy spożycie pokarmu u Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film opisuje test CApillary FEeder, czyli CAFE, metodę behawioralną, która mierzy spożycie pokarmu i preferencje niepohamowanych muszek owocowych. Przedstawiony protokół pokazuje, jak przeprowadzić test przy minimalnym parowaniu z wypełnionych płynem naczyń włosowatych używanych do dostarczania pokarmu i śledzenia jego spożycia.

Protokół

Ten protokół jest fragmentem z Diegelmann et al., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montaż i wykonanie testu FEeder CApillary

1. Jeśli post nie jest potrzebny, przenieść muchy doświadczalne do testu, stukając lub za pomocą dmuchawki. Należy upewnić się, że dołączono trzy fiolki kontrolne bez much, aby określić ilościowo parowanie.
2. Ostrożnie wyjmij końcówkę pipety (objętość 2 - 20 μl), która zamyka jeden z zewnętrznych otworów, i włóż wypełnioną szklaną kapilę od dołu. Zabezpiecz kapilarę, umieszczając końcówkę pipety z powrotem obok kapilary. Jeśli testowanych jest kilka roztworów spożywczych, powtórz tę procedurę odpowiednio.
3. Umieść końce kapilar we wszystkich fiolkach na tym samym poziomie, aby uniknąć odchyleń, które mogłyby wystąpić, gdyby źródła pożywienia znajdowały się na różnych wysokościach (3 - 4 cm od pokrywki); zachowaj odległość od bibuły filtracyjnej, aby zapobiec wyciekowi kapilary przez przypadkowe dotknięcie bibuły filtracyjnej lub różnych lepkości źródeł żywności.
4. Oznacz górny koniec kolorowej cieczy za pomocą markera (zaznacz_początek). Aby upewnić się, że można zidentyfikować różne kapilary, oznacz je indywidualnie za pomocą kodu koloru lub paska.
5. Umieść wiele przygotowanych testów CAFE w plastikowym pudełku z wkładką z siatką i przenieś pudełko (Rysunek 2A) do bezpiecznej pozycji w warunkach laboratoryjnych lub w komorze klimatycznej o kontrolowanej temperaturze, świetle i wilgotności (parametry: 25 °C, 60% wilgotności względnej, 12 godzin/12 godzin cyklu jasnej ciemności) na okres doświadczalny (np. 3 godziny lub dni).
6. Ponieważ dolna bibuła filtracyjna wysycha, jeśli test jest wykonywany przez kilka dni, należy nanosić świeżą wodę co 24 godziny przez korek gąbki (100 μl), aby utrzymać stałą wilgotność wewnątrz testu. Użyj czterech oddzielnych fiolek (8 cm wysokości, 3,3 cm średnicy) wypełnionych 30 ml ddH₂O jako urządzeń nawilżających i umieść je obok testów CAFE w plastikowym pudełku. Użyj pokrywy na plastikowe pudełko, aby stworzyć środowisko o kontrolowanej wilgotności podczas eksperymentu (Rysunek 2A).
   UWAGA: Większa zmienność występuje w warunkach laboratoryjnych; jednak możliwe jest wykonanie testu CAFE w temperaturze pokojowej (np. w klasie). Zdecydowanie zaleca się stosowanie urządzenia nawilżającego (bibuła filtracyjna, z mokrą zatyczką z gąbki lub bez, napełnione fiolki z wodą i pokrywka plastikowego pudełka) w celu zmniejszenia parowania (Rysunek 2B).
7. Wymieniaj kapilary na świeżo napełnione do długotrwałych eksperymentów co 24 godziny. Zanotuj martwe muchy przed każdym 24-godzinnym odstępem i użyj liczby żywych much do obliczenia zużycia na muchę w następnym okresie. Wyrzucić stare naczynia włosowate po zmierzeniu spadku łąkotki (patrz 2.1).
   UWAGA: Podczas trwającego 3 godziny eksperymentu prawie nie widzimy martwych muszek. Podczas 4-dniowego badania znajdujemy zwykle 1 - 3 martwe muchy.
8. Pod koniec testu lub przed wymianą kapilary należy oznaczyć dolną łąkotkę kapilary (zaznaczyć_koniec) markerem, gdy test CAFE jest nadal w pozycji pionowej. Odrzuć dane, jeśli_koniec znaku nie znajduje się poniżej początkowego znaku (_początek znaku). Nie zdejmuj pokrywy, ponieważ może to spowodować zmianę łąkotki.
9. Ostrożnie usuń naczynia włosowate z testu i przechowuj je w celu zebrania danych. Sprawdź, czy płyn wewnątrz kapilary osiągnął dolny koniec, jeśli nie, odrzuć dane, ponieważ pokarm nie był dostępny dla much. Zebrać wszystkie naczynia włosowate w fiolce jako grupę. Włóż nieobcięte końcówki pipet do wszystkich otworów, aby zapobiec ucieczce much. Zdemontuj zestaw i umyj fiolki, pokrywki i korki z gąbki w kąpieli mydlanej i wysusz przez noc w temperaturze pokojowej do dalszego użycia.
   UWAGA: Muchy mogą być dalej analizowane po teście. Potwierdź pobieranie pokarmu okiem lub pod mikroskopem preparacyjnym.
10. Powtórz eksperymenty z tymi samymi genotypami w co najmniej trzech różnych dniach.

2. Gromadzenie i analiza danych

1. Zmierz odległość między_początkiem znaku a_końcem znaku na kapilarze za pomocą suwmiarki lub linijki. Aby przesłać dane bezpośrednio do arkusza kalkulacyjnego, użyj suwmiarki cyfrowej podłączonej do USB (Universal Serial Bus) (Rysunek 1E). Wyrzuć naczynia włosowate po pomiarze.
2. Uwzględnij wielkość kapilary, aby obliczyć pobieranie lub parowanie pokarmu. Weźmy na przykład kapilatę o długości 73 mm i zawierającej 5 μl roztworu spożywczego. Zmniejszenie menisku o 14,6 mm odzwierciedla pobieranie 1 μl roztworu. Oblicz pobranie pokarmu, korzystając z następującego wzoru:
   Pobór pokarmu (μL) = zmierzona odległość (mm)/ 14,6 mm
3. Aby wykluczyć wpływ parowania na przyjmowanie pokarmu, należy obliczyć średnie parowanie w trzech (co najmniej) fiolkach kontrolnych bez much. Odejmij tę średnią wartość od wartości uzyskanej do spożycia przez muchy w celu spożycia.
4. Użyj następującego wzoru, aby określić całkowite zużycie na muchę:
   Spożycie pokarmu (μL) = (Pobór pokarmu [μL] - Utrata parowania [μL])/całkowita liczba much w fiolce. Do długotrwałych eksperymentów należy wykorzystać liczbę much żyjących przed rozpoczęciem 24-godzinnego interwału.
5. Aby uwzględnić różnice w wielkości ciała, na przykład między samcami i samicami much, znormalizuj spożycie pokarmu do masy ciała (μL pokarmu/mg muchy).
6. Korzystaj z oprogramowania statystycznego do analizy danych. W przypadku danych o rozkładzie normalnym użyj testów T Studenta, aby określić różnice między dwiema grupami much, i użyj ANOVA (analizy wariancji) z testami Tukeya Cramera post hoc dla więcej niż dwóch grup. W sytuacji wyboru przeanalizuj różnice w stosunku do wyboru losowego za pomocą nieparametrycznego testu znaku dla jednej próby.

Wyniki

Rycina 1: Test Drosophila melanogaster CApillary FEeder. A) Test karmienia muchami. Zwilżona bibuła filtracyjna dostarcza wodę na dno fiolki. Podczas eksperymentu zapewnione są cztery naczynia włosowate (pokarm o czerwonym i niebieskim kolorze w przeciwległych naczyniach włosowatych). Należy pamiętać, że kapilary są zabezpieczone na miejscu za pomocą drugiej końcówki pipety, a nieużywane pozycj...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fiolki (hodowlane)	Greiner Bio-One	960177	www.greinerbioone.com
Fiolki (test CAFE)	Greiner Bio-One	217101	www.greinerbioone.com
Test Lid-CAFE	warsztat	–	–
Skrzynka plastikowa, niska ścianka	Plastime	Rozdział 353	www.plastime.it
Pokrowiec na plastikowe pudełko	warsztat	–	–
Naczyń włosowatych	BLAUBRAND	REF 7087 07	www.brand.de
Końcówki do pipet	Greiner Bio-One	Numer katalogowy: 771290	www.greinerbioone.com
Filtruj okręgi z bibuły	Whatman	10 311 804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sacharoza	Zastosowanie	57-50-1	www.applichem.com
Absolutny etanol	Firma VWR Chemicals	20 821 330	www.vwr.com
Barwnik spożywczy (czerwony, E124)	Zabawa w plecy	Numer katalogowy 10027	www.backfun.de
Barwnik spożywczy (niebieski, E133)	Zabawa w plecy	Numer katalogowy 10030	www.backfun.de
Roztwór mydła (CVK 8)	Certyfikat CVH	Numer katalogowy: 103220	www.cvh.de
Suwmiarka cyfrowa	GARANT	412 616	www.hoffmann-group.com
Fiolki (hodowlane)			Wysokość 9,8 cm, średnica 4,8 cm
Fiolki (test CAFE)			Wysokość 8 cm, średnica 3,3 cm
Test Lid-CAFE			Wyprodukowano w warsztacie uniwersyteckim, w zestawie rysunek techniczny Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Skrzynka plastikowa, niska ścianka			Wkładka z tworzywa sztucznego została wykonana na zamówienie dla pozycji fiolek 8 x 10
Pokrowiec na plastikowe pudełko			Wymiary (37 x 29 x 18 cm)
Naczyń włosowatych			Norma DIN ISO 7550, wytyczne IVD 98/79 EG, końcówki polerowane
Końcówki do pipet			Pipety do zewnętrznego koła są cięte zgodnie z pokrywką
Filtruj okręgi z bibuły			Średnica 45 mm dobrze się sprawdza po złożeniu do używanych fiolek
D(+)-Sacharoza			Nie nadaje się do stosowania
Absolutny etanol			Wysoce łatwopalna ciecz i para
Barwnik spożywczy (czerwony, E124)			Nie podano
Barwnik spożywczy (niebieski, E133)			Nie podano
Roztwór mydła (CVK 8)			Mydło o neutralnym zapachu
Suwmiarka cyfrowa
Standardowa karma dla much			(na 20 L)
agar			160 gramów
Drożdże piwne			299,33 gr
Kukurydziana			1 200 gramów
melasa			1,6 l
Kwas propionowy			57,3 ml
Nipagin 30%			160 ml

szt. osób osób