Ten protokół jest fragmentem artykułu Tenenbauma i Gavisa, Usuwanie tkanki mięśniowej Drosophila z filetów larwalnych w celu analizy immunofluorescencji neuronów czuciowych i komórek naskórka, J. Vis. Exp.(2016).
UWAGA: Procedura usuwania mięśni (Rysunek 1) jest modyfikacją wcześniej opisanych metod przygotowania filetów larwalnych. Kroki, które poprzedzają i następują po usunięciu mięśni, są pokrótce przedstawione, a czytelnik jest odsyłany do poprzednich prac w Brent, et al., J. Vis. Exp. (2009) oraz Karim and Moore, J. Vis. Exp. (2011) w celu uzyskania bardziej szczegółowych opisów.
1. Rozkrój larwy w zimnej soli fizjologicznej
- Przygotować robocze rozcieńczenie zimnego roztworu soli fizjologicznej HL3.1 lub zimnego roztworu soli fizjologicznej HL3.1 wolnego od Ca2+ (Tabela 1). Umieść larwę w naczyniu z elastomeru silikonowego z taką ilością zimnego soli fizjologicznej, aby pokryć dno naczynia.
UWAGA: Zalecamy eksperymentowanie z użyciem soli fizjologicznej HL3.1 wolnej od Ca2+ w porównaniu ze standardową solą fizjologiczną HL3.1 podczas sekcji larw. W przypadku braku wapnia skurcze mięśni larw są znacznie zmniejszone. W związku z tym filety larwalne mogą być łatwiejsze do manipulowania po wypreparowaniu w soli fizjologicznej HL3.1 wolnej odCa2+. Okazuje się jednak, że skurcz mięśni tworzy przestrzeń między mięśniem a naskórkiem, co może ułatwić wprowadzenie kleszczy między te tkanki, jednocześnie minimalizując ryzyko uszkodzenia naskórka. W rezultacie, standard HL3.1 może być preferowany dla zachowania integralności naskórka i neuronów da. Dobre wyniki uzyskujemy zarówno z solą fizjologiczną, jak i wyborem pozostawia się użytkownikowi.
- Ustaw larwę brzuszną stroną do góry. Brzuszną powierzchnię larwy można rozpoznać po brzusznych pasach zębowych, a stronę grzbietową po pierwotnych rurkach tchawicy larwalnej biegnących od przedniej do tylnej. Rozciągnij larwę w kierunku przednio-tylnym i przypnij głowę i ogon do naczynia preparacyjnego z elastomeru silikonowego za pomocą szpilek do owadów. Użyj cienkich nożyczek do preparowania, aby ciąć wzdłuż brzusznej linii środkowej, zaczynając od jednego końca i postępując w kierunku drugiego.
UWAGA: Ta orientacja zachowuje powszechnie badane grzbietowe skupisko neuronów da.
- Po rozcięciu larwy przypnij cztery rogi do naczynia preparacyjnego, tak jakbyś otwierał książkę. Użyj kleszczy, aby chwycić i usunąć narządy wewnętrzne, w tym OUN, jelito i tchawicę. Wyreguluj szpilki owadów tak, aby filet był napięty, ale nie maksymalnie rozciągnięty.
UWAGA: Mięśnie są zakotwiczone w ścianie ciała na granicach segmentów. Chociaż mięśnie pokrywają większość ściany ciała, są nieobecne w wąskim obszarze w pobliżu grzbietowej linii środkowej.
2. Usuwanie mięśni
- Zlokalizuj grzbietową linię środkową larwy, w której nie ma tkanki mięśniowej. Ustaw pojedynczy ząb kleszczowy tak, aby można go było włożyć pod tkankę mięśniową w możliwie najbardziej płaskiej orientacji.
- Zaczynając od grzbietowej linii środkowej, w pobliżu przedniej granicy segmentu, ostrożnie wsuń kleszcze między mięsień a naskórek, uważając, aby zminimalizować kontakt kleszczyków z naskórkiem.
- Pociągnij kleszcze do góry, aby zerwać przyczep mięśnia do ściany ciała w jednym punkcie kotwiczenia. Powtórz ten proces dla pozostałych segmentów półkuli będących przedmiotem zainteresowania.
UWAGA: Protokół ten optymalizuje zachowanie tylnej części każdego pola dendrytowego neuronu da. Aby zachować przednią część pola dendrytowego, najlepiej jest umieścić bolec kleszczowy na tylnym końcu każdego segmentu.
- Ponownie wyreguluj szpilki owadów tak, aby filet larwalny był maksymalnie rozciągnięty we wszystkich kierunkach.
- Utrwal filet, gdy jest jeszcze przypięty do naczynia preparującego, używając zimnego, świeżo przygotowanego 4% formaldehydu w PBS przez 25 minut.
- Spłucz 5 razy w PBS.
- Za pomocą kleszczy ostrożnie odciągnij tkankę mięśniową od pozostałych punktów kotwiczenia, uważając, aby zminimalizować kontakt z naskórkiem.
- Odpiąć filet i wyjąć go z naczynia preparacyjnego do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wykonaj wszystkie kolejne etapy mycia, blokowania i barwienia immunofluorescencyjnego, jak opisano wcześniej w Karim i Moore, J. Vis. Exp. (2011).
