Ten protokół jest fragmentem z Reimelsa i Pflegera, Metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. Immunohistochemia larwalnych gruczołów chłonnych
UWAGA: Gruczoł limfatyczny znajduje się w przybliżeniu jednej trzeciej długości od przedniego końca larwy nieco poniżej mózgu po stronie grzbietowej. (Patrz strzałka w Rysunek 1B.) Gruczoł limfatyczny flankuje naczynie grzbietowe i najłatwiej go rozciąć przyczepiając do haczyków gębowych lub do mózgu. Gruczoły limfatyczne typu dzikiego w trzecim stadium chorobowym są bardzo małymi strukturami; Płaty pierwotne mają długość około 100 - 200 μm. (Zobacz Rysunek 2A.)
- Aby uzyskać larwy o mniej więcej tym samym etapie rozwoju dla tego testu, należy ograniczyć zbieranie jaj, pozwalając samicom na składanie jaj przez określony czas 2 - 6 godzin.
- Rozwarstwienie gruczołów chłonnych
- Dla każdego warunku doświadczalnego dodać 1 ml 1x PBS (Tabela 1) do jednego dołka na płytce 24-dołkowej.
- Dodać 1 kroplę 0,1% PBST (Tabela 1) do każdej studzienki za pomocą jednorazowej pipety transferowej.
UWAGA: Detergent, taki jak Tween 20, jest dodawany w celu obniżenia napięcia powierzchniowego, dzięki czemu tkanka opada na dno studzienki.
- Połóż talerz płasko na lodzie.
- Zbieraj larwy w dołkach preparacyjnych wypełnionych 1x PBS.
- Umieść czystą podkładkę sekcyjną na oświetlonej podstawie mikroskopu stereoskopowego. Za pomocą jednorazowej pipety transferowej umieść małe krople 0,01% PBST (Tabela 1) na podkładce. Przenieś jedną larwę do kropli PBST w celu rozwarstwienia.
- Trzymaj larwę jedną parą kleszczy około jednej czwartej długości od tylnego końca, grzbietem do góry.
- Użyj innej pary kleszczy, aby chwycić naskórek bezpośrednio przed kleszczami, które trzymają larwę. Delikatnie pociągnij naskórek w kierunku przedniego końca, aż haczyki do ust zostaną odsłonięte.
UWAGA: Celem jest złuszczenie naskórka bez naruszania jakichkolwiek struktur wewnętrznych.
- Zwolnij naskórek i użyj obu kleszczy, aby przeciąć larwę na pół. Usuń tylny koniec z kropli PBST.
UWAGA: Jeśli naskórek nie złuszczy się aż do haczyków gębowych, przetnij larwę na dwie części i usuń tylny koniec. Użyj jednej pary kleszczy, aby przytrzymać krawędź naskórka, a drugiej pary kleszczy, aby wepchnąć haczyki do ust przez otwór. Spowoduje to odwrócenie naskórka i odsłonięcie haczyków do ust. Może to być również stosowane jako alternatywna metoda sekcji.
- Użyj jednej pary kleszczy, aby przygwoździć naskórek (naskórek brzuszny, płat naskórka grzbietowego lub oba), aby uzyskać stabilność.
- Użyj innej pary kleszczy, aby chwycić odsłonięte haczyki na usta i delikatnie je wyciągnij.
UWAGA: To oddzieli naskórek od struktur wewnętrznych. Idealnie byłoby, gdyby krążki imaginalne oka/czułka, mózg, gruczoł pierścieniowy i gruczoł limfatyczny otaczający naczynie grzbietowe pozostały przyczepione do haczyków ustnych.
- Trzymając haczyki do ust, ostrożnie usuń niechciane struktury, takie jak gruczoły ślinowe, ciało tłuszczowe i jelita.
UWAGA: Jeśli mózg oddzieli się od haczyków w ustach, gruczoł limfatyczny może nadal być przyczepiony i zebrany wraz z mózgiem. W takim przypadku trzymaj brzuszny rdzeń nerwowy zamiast haczyków ustnych.
- Używając haczyków ustnych lub brzusznego rdzenia nerwowego jako uchwytu, przenieś wypreparowany kompleks zawierający gruczoł limfatyczny do studni na lodzie. Nie należy przekraczać 30 minut przed utrwaleniem.
- Utrwalenie i immunohistochemia
- Umieść 24-dołkową płytkę na podstawie mikroskopu stereoskopowego.
- Użyj pipety p200, aby ostrożnie usunąć PBST z dołka.
UWAGA: Puste, sąsiednie studnie przydają się do tymczasowego składowania odpadów.
- Delikatnie dodaj 200 μl 3,7% formaldehydu (Tabela 1) z boku studzienki i zakręć płytką, aby upewnić się, że wypreparowane tkanki są całkowicie zanurzone.
- Włóż płytkę z powrotem do lodu na 30 minut. Jeśli gruczoły limfatyczne wyrażają białka fluorescencyjne, przykryj płytkę, aby zapobiec fotowybielaniu.
- Użyj pipety p200, aby ostrożnie usunąć utrwalacz.
- Przemyć, dodając 200 μl 1x PBS do studzienki i umieszczając płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 5 minut w temperaturze pokojowej. Użyj pipety p200, aby ostrożnie wyjąć PBS.
UWAGA: Stałe gruczoły limfatyczne można pozostawić na lodzie w PBS, dopóki gruczoły limfatyczne dla wszystkich warunków eksperymentalnych nie zostaną wycięte i naprawione.
- Powtórz kroki prania jeszcze dwa razy.
- Dodać 200 μl roztworu przepuszczalnego (tabela 1) do studzienki. Ustaw płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 45 minut w RT.
UWAGA: 45 minut to "złoty standard" dla przepuszczalności gruczołów limfatycznych, ale autorzy odnoszą sukces już po 20 minutach.
- Usunąć roztwór za pomocą pipety p200.
- Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe roztworem przeciwciała (Tabela 1) zgodnie ze specyfikacją dostawcy. Dodać 300 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do studzienki i upewnić się, że wypreparowane tkanki są całkowicie zanurzone. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
- Użyj pipety p200, aby usunąć przeciwciało pierwotne.
- Przemyć, dodając 200 μl 1x PBS do studzienki i umieszczając płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 10 minut w temperaturze pokojowej. Użyj pipety p200, aby ostrożnie wyjąć PBS.
- Powtórz kroki prania jeszcze dwa razy.
- Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe roztworem przeciwciała zgodnie ze specyfikacją dostawcy. Dodać 300 μl roztworu przeciwciał wtórnych do studzienki i upewnić się, że wypreparowane tkanki są całkowicie zanurzone. Inkubować na wytrząsarce orbitalnej przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Użyj pipety p200, aby usunąć przeciwciało wtórne i przemyć zgodnie z opisem w krokach 1.3.12 i 1.3.13. Nie wyjmuj PBS po ostatnim praniu.
- Montaż gruczołów limfatycznych
- Wyczyść szklane szkiełka mikroskopowe za pomocą 70% etanolu (Tabela 1) i chusteczek do tkanek.
- Dla każdego warunku doświadczalnego umieścić jedną kroplę bufora montażowego (Tabela 1) na szkiełku podstawowym.
UWAGA: Na jednej prowadnicy mieszczą się dwa warunki. Objętość bufora montażowego zależy od liczby gruczołów limfatycznych, które mają być zamontowane. Użyj 2 μl dla około 18 - 20 gruczołów limfatycznych, 1 μl dla 10 - 12 i 0,5 μl dla 5 lub mniej.
- Umieść szkiełko mikroskopowe na podświetlanej podstawie mikroskopu stereoskopowego.
- W maksymalnie dwóch warunkach jednocześnie przenieś wszystkie gruczoły limfatyczne ze studzienki do bufora montażowego za pomocą kleszczy, używając haczyków ustnych lub brzusznego rdzenia nerwowego jako uchwytu.
- Rozmieść wypreparowane tkanki równomiernie w okrągłym lub prostokątnym kształcie, rozprowadzając przy tym bufor montażowy.
- Dla każdej z wypreparowanych tkanek, indywidualnie, wsuń jeden szczypiec kleszczyków pod naczynie grzbietowe i delikatnie pociągnij w kierunku obwodu bufora montażowego.
UWAGA: Spowoduje to wyciągnięcie gruczołu limfatycznego z reszty wypreparowanych tkanek i spłaszczenie gruczołu limfatycznego na szkle.
- Za pomocą jednego szczypiec kleszczowych i ruchu piłowania przeciąć naczynie grzbietowe między gruczołem limfatycznym a mózgiem.
- Przenieść resztę wypreparowanych tkanek na przeciwną stronę gruczołu chłonnego, na najbardziej zewnętrzną krawędź buforu.
UWAGA: Niechciane wypreparowane tkanki ostatecznie utworzą obwód wokół gruczołów limfatycznych i posłużą jako podpora, na której spocznie szkiełko nakrywkowe.
- Powtarzaj, aż wszystkie gruczoły limfatyczne zostaną oddzielone od wypreparowanych tkanek, zachowując jedną z niechcianych wypreparowanych tkanek do umieszczenia w środku.
- Weź szkiełko nakrywkowe między dwoma palcami. Sprawdź, czy szkiełko nakrywkowe jest wolne od kurzu i odcisków palców. W razie potrzeby użyj chusteczki higienicznej i 70% etanolu, aby wyczyścić szkiełko nakrywkowe.
- Upewniając się, że krawędź szkiełka nakrywkowego jest równoległa do krawędzi szkiełka nakrywkowego, ostrożnie opuść szkiełko nakrywkowe na zderzak montażowy.
UWAGA: Szkiełka mikroskopowe mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem. Maksymalny czas przechowywania zależy od stabilności zastosowanych przeciwciał. Płytki 24-dołkowe można wypłukać i ponownie użyć.
2. Obrazowanie
- Obraz utrwalonych hemocytów i zamontowanych gruczołów limfatycznych na odpowiednim standardowym mikroskopie fluorescencyjnym lub konfokalnym przy powiększeniu 20X lub większym zgodnie z instrukcją obsługi producenta. Obraz całych larw na standardowym mikroskopie stereoskopowym przy 2-krotnym powiększeniu zgodnie z instrukcją obsługi producenta.
- W razie potrzeby postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy oprogramowania dotyczącymi dekonwolucji.
