Method Article

Pomiar sztywności na zginanie komórek bakteryjnych za pomocą pułapki optycznej

DOI:

10.3791/2012

⸱

April 26th, 2010

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology, Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, 2Department of Physics, Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół zginania nitkowatych komórek bakteryjnych przymocowanych do powierzchni szkiełkowej za pomocą pułapki optycznej do pomiaru sztywności zginania komórek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Opracowaliśmy protokół pomiaru sztywności zginania bakterii nitkowatych w kształcie pręcików. Siły są przykładane za pomocą pułapki optycznej, mikroskopijnej trójwymiarowej sprężyny wykonanej ze światła, która powstaje, gdy wiązka laserowa o dużej intensywności jest skupiana na bardzo małym punkcie przez soczewkę obiektywu mikroskopu. Aby zgiąć komórkę, najpierw wiążemy żywe bakterie z chemicznie poddanym obróbce szkiełkiem nakrywkowym. W miarę wzrostu tych komórek środek komórek pozostaje związany ze szkiełkiem nakrywkowym, ale rosnące końce są wolne od tego ograniczenia. Indukując nitkowaty wzrost za pomocą leku cefaleksyny, jesteśmy w stanie zidentyfikować komórki, w których jeden koniec komórki był przyklejony do powierzchni, podczas gdy drugi koniec pozostał nieprzyczepiony i podatny na siły zginające. Siła zginająca jest następnie przykładana za pomocą pułapki optycznej poprzez przywiązanie koralika pokrytego polilizyną do końcówki rosnącej komórki. Rejestrowana jest zarówno siła, jak i przemieszczenie ściegu, a sztywność komórki na zginanie jest nachyleniem tej zależności.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoduj komórki E. coli w bulionie Luria-Beltrani (LB) w fazie średniej do wykładniczej (OD = 0,2-0,4).
  2. Hoduj kulturę w LB uzupełnionym 50 μg/ml cefaleksyny przez 15 minut, aby wywołać nitkowaty wzrost, a następnie zagęścić kulturę 5 razy przez wirowanie.
  3. Szkiełko nakrywkowe z powłoką PEI należy sporządzić poprzez przepuszczenie 1% polietylenininy rozcieńczonej w wodzie do komory przepływowej i przemyć wodą po 5-minutowej inkubacji.
  4. Przelej skoncentrowaną hodowlę komórkową do komory i umyj mieszaniną LB i cefaleksyny (50 μg / ml) po 3 minutach w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek.
  5. Inkubować komorę w temperaturze 37°C przez 30 minut do 1 godziny, aby umożliwić wzrost przyłączonym komórkom przed umieszczeniem na przyrządzie do pułapki optycznej.
  6. Wykonaj kulki pokryte polilizyną, inkubując kulki polistyrenowe o średnicy 0,5 μm (Bangs Labs) w 0,1% polilizynie rozcieńczonej w wodzie przez 30 minut. Następnie umyj koraliki 3 razy i ponownie zanurz w wodzie.
  7. Rozcieńczyć roztwór kulki dwukrotnie do LB z cefaleksyną (50 μg/ml) i dodać go do komory przepływowej.
  8. Optycznie uwięzij pływający koralik i przyłóż go do wolnego końca komórki. (Używamy stolika piezoelektrycznego Mad City Labs do kontrolowania ruchu próbki.) Po znalezieniu odpowiedniej kombinacji kulka/komórka umyj komorę cefaleksyną w LB (50 μg / ml), aby usunąć nieprzyczepione kulki.
  9. Uruchom niestandardowy program LabView, aby przyłożyć siły zginające do komórki i zapisać dane dotyczące siły i przemieszczenia. Szczegóły programu
    1. Kalibracja odpowiedzi detektora poprzez skanowanie rastrowe dołączonego koralika w wykrywającej wiązce laserowej i rejestrację sygnałów napięciowych 3D PSD.
    2. Zidentyfikuj długą oś komórki na obrazie mikroskopowym.
    3. Przesuwaj komórkę krok po kroku w kierunku prostopadłym do długiej osi komórki.
    4. Rejestruj przebytą odległość i przemieszczenie od pułapki optycznej.
    5. Przekształć przemieszczenie na przyłożoną siłę, korzystając z wcześniej zmierzonej sztywności pułapki i zapisz przemieszczenie końcówki oraz siłę do pilnika.

Sekrety sukcesu: W kroku 8) należy znaleźć komórkę z dobrze zdefiniowanym zablokowanym końcem. Niektóre komórki po prostu utknęły na jednej końcówce, a siła zginająca na drugiej końcówce prowadzi do obracania całej komórki, a nie do zginania. Odpowiednią parę można znaleźć, szybko zginając każdą komórkę ręcznie za pomocą sterowanego joystickiem ruchu stolika.

Reprezentatywne wyniki:

figure-protocol-1
Rysunek 1. Na tym rysunku przedstawiono dane dotyczące siły i przemieszczenia dla pojedynczej komórki. Nachylenie tej linii to sztywność komórki na zginanie.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół ma na celu ilościowy pomiar właściwości zginania komórek bakteryjnych. Konfigurację eksperymentu można zastosować do dowolnej komórki w kształcie pręcika, którą można zmusić do wzrostu nitkowatego. Z powodzeniem wykorzystaliśmy ten układ do zbadania wpływu włókien cytoszkieletu na sztywność zginania komórek E. coli . Ta sama technika może być wykorzystana do oceny roli ciśnienia, sztywności ściany komórkowej i innych składników wewnątrzkomórkowych w określaniu ogólnej sztywności komórek przy zginaniu.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja wideo do tego artykułu była sponsorowana przez Mad City Labs, które produkuje instrumenty używane w tych badaniach.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przyjmujemy pomocne rady od Mingzhai Sun na temat wiązania komórek z powierzchniami. Dziękujemy Nedowi Wingreenowi i Zemerowi Gitai za cenne dyskusje. Badania te były wspierane przez National Institutes of Health grant P50GM07150, nagrodę National Science Foundation CAREER PHY-0844466 oraz Fundację Alfreda P. Sloana.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cefaleksynaSigma-AldrichC4895-5G
polietyleninaSigma-Aldrich181978-5G
polilizynaSigma-AldrichP8920
0,5-μ Koraliki polistyrenowe o średnicy mBangs LaboratoriesPS03N
Seria Nano-LPMad City LabsSeria NanoLPhttp://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html
System nanopozycjonowania

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
  2. Morris, D. M., Jensen, G. J. Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells. Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bending StiffnessOptical TrapBacterial CellsFilamentous GrowthCephalexin TreatmentForce Displacement MeasurementPolylysine Coated BeadsChemically Treated CoverslipTrap Stiffness CalibrationLinear Fit Analysis

Related Articles