Przedstawiamy protokół wyginania nitkowatych komórek bakteryjnych przytwierdzonych do powierzchni szkiełka podstawowego za pomocą pułapki optycznej w celu pomiaru sztywności zgięciowej komórek.
Artykuł metodologiczny
Pomiar sztywności zginania komórek bakteryjnych z wykorzystaniem pułapki optycznej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opracowaliśmy protokół służący do pomiaru sztywności zginania nitkowatych bakterii o kształcie pręcika. Siły są przyłożone za pomocą pułapki optycznej, czyli mikroskopowej trójwymiarowej sprężyny zbudowanej ze światła, która powstaje, gdy wiązka lasera o wysokiej intensywności zostaje skupiona w bardzo małym punkcie przez obiektyw mikroskopu. Aby zegnąć komórkę, najpierw wiążemy żywe bakterie z chemicznie potraktowanym szkiełkiem podstawowym. W miarę wzrostu komórek ich środkowa część pozostaje związana ze szkiełkiem, natomiast rosnące końce są wolne od tego ograniczenia. Poprzez indukowanie wzrostu nitkowatego za pomocą leku cefaleksyna jesteśmy w stanie zidentyfikować komórki, w których jeden koniec przylega do powierzchni, podczas gdy drugi pozostaje nieprzymocowany i podatny na siły zginania. Następnie siła zginania jest przyłożona za pomocą pułapki optycznej poprzez przywiązanie koralika pokrytego polilizyną do końcówki rosnącej komórki. Rejestrowane są zarówno siła, jak i przemieszczenie koralika, a sztywność zginania komórki stanowi nachylenie tej zależności.
Protokół
- Hodować komórki E. coli w bulionie Luria-Bertani (LB) do fazy wykładniczej (OD = 0,2-0,4).
- Hodować kulturę w pożywce LB uzupełnionej o 50 μg/mL cefaleksyny przez 15 min w celu indukcji wzrostu filamentowatego, a następnie skoncentrować kulturę 5-krotnie poprzez wirowanie.
- Przygotować szkiełko nakrywkowe pokryte PEI, wprowadzając 1% polietyleniminy rozcieńczonej w wodzie do komory przepływowej, a następnie przemyć wodą po 5-minutowej inkubacji.
- Wprowadzić skoncentrowaną kulturę komórek do komory i przemyć mieszaniną LB i cefaleksyny (50 μg/mL) po 3 min, aby usunąć nieprzyległe komórki.
- Inkubować komorę w temperaturze 37°C przez 30 min-1 h, aby umożliwić wzrost przytwierdzonych komórek przed umieszczeniem w urządzeniu do pułapkowania optycznego.
- Przygotować kuleczki pokryte polilizyną, inkubując polistyrenowe kuleczki o średnicy 0,5 μm (Bangs Labs) w 0,1% polilizyny rozcieńczonej w wodzie przez 30 min. Następnie przemyć kuleczki 3 razy i resuspendować w wodzie.
- Rozcieńczyć roztwór kuleczek dwukrotnie w pożywce LB z cefaleksyną (50 μg/mL) i wprowadzić do komory przepływowej.
- Uchwycić optycznie pływającą kuleczkę i dotknąć nią wolnego końca komórki. (Do sterowania ruchem próbki używamy stolika piezoelektrycznego Mad City Labs). Po znalezieniu odpowiedniej kombinacji kuleczka/komórka, przemyć komorę cefaleksyną w LB (50 μg/mL), aby usunąć nieprzyległe kuleczki.
- Uruchomić dedykowany program LabView w celu przyłożenia sił zginających do komórki i zarejestrowania danych siła-przemieszczenie.
Szczegóły programu
- Zkalibrować odpowiedź detektora poprzez skanowanie rastrowe przytwierdzonej kuleczki w wiązce lasera detekcyjnego i rejestrację sygnałów napięcia 3D PSD.
- Zidentyfikować oś długą komórki na obrazie mikroskopowym.
- Przesuwać komórkę skokowo w kierunku prostopadłym do jej osi długiej.
- Zarejestrować przebytą odległość oraz przemieszczenie względem pułapki optycznej.
- Przeliczyć przemieszczenie na przyłożoną siłę, korzystając z wcześniej zmierzonej sztywności pułapki, i zapisać przemieszczenie końca oraz siłę do pliku.
Klucze do sukcesu: W kroku 8) należy znaleźć komórkę z wyraźnie unieruchomionym końcem. Niektóre komórki są przymocowane tylko jednym końcem, przez co siła zginania przy drugim końcu prowadzi do obrotu całej komórki zamiast jej zgięcia. Odpowiednią parę znajduje się, szybko zginając każdą komórkę ręcznie za pomocą ruchu stolika sterowanego dżojstikiem.
Reprezentatywne wyniki:
Rycina 1. Na tej rycinie przedstawiono dane dotyczące siły i przemieszczenia dla pojedynczej komórki. Nachylenie tej linii określa sztywność na zginanie komórki.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół został opracowany w celu ilościowego pomiaru właściwości zginania komórek bakteryjnych. Konfiguracja eksperymentalna może być zastosowana do każdej komórki o kształcie pręcika, którą można pobudzić do wzrostu filamentowego. Z sukcesem wykorzystaliśmy ten układ do badania wpływu filamentów cytoszkieletu na sztywność zginania komórek E. coli. Ta sama technika może być użyta do oceny roli ciśnienia, sztywności ściany komórkowej oraz innych komponentów wewnątrzkomórkowych w określaniu ogólnej sztywności zginania komórek.
Oświadczenia
Produkcja wideo do tego artykułu była sponsorowana przez Mad City Labs, firmę produkującą instrumenty wykorzystane w tych badaniach.
Podziękowania
Wyrażamy wdzięczność Mingzhai Sun za pomocne wskazówki dotyczące wiązania komórek z powierzchniami. Dziękujemy Nedowi Wingreenowi oraz Zemerowi Gitai za wartościowe dyskusje. Badania te były wspierane przez grant National Institutes of Health P50GM07150, nagrodę National Science Foundation CAREER PHY-0844466 oraz Fundację Alfreda P. Sloana.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| cefaleksyna | Sigma-Aldrich | C4895-5G | |
| polietylenoimina | Sigma-Aldrich | 181978-5G | |
| polilizyna | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| kulki polistyrenowe o średnicy 0,5-μm | Bangs Laboratories | PS03N | |
| system nanopozycjonowania serii Nano-LP | Mad City Labs | NanoLP series | http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html |
Bibliografia
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Morris, D. M., Jensen, G. J. Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells. Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).
Przedruki i uprawnienia
