$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem z Koyle et al., Hodowla muszki owocowej Drosophila melanogaster w warunkach aksenicznych i gnotobiotycznych, J. Vis. Exp. (2016).
1. Jaja dechorionate i przejście na bezpłodną dietę
- Przygotuj komorę bezpieczeństwa biologicznego, spryskując jej wnętrze (w tym boki) 70% etanolem. Przetrzyj spód chusteczką laboratoryjną i sterylizuj kaptur światłem UV przez ~15 min. Wysterylizuj wszystkie materiały niebiologiczne (kubki na próbki, pędzel, kleszcze, pojemnik na odpady, 400 ml wysterylizowanej wody i 100 ml 0,6% podchlorynu sodu) poprzez spryskanie etanolem i natychmiastowe umieszczenie w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Sterylizuj światłem UV przez 15 minut.
- Rozpocznij pierwsze z 2 płukań podchlorynem sodu, umieszczając tuleję z jajami w kubku na próbkę o pojemności 120 ml lub innym sterylnym pojemniku. Powoli wlej ~90 ml 0,6% roztworu podchlorynu sodu do tulei, aż znajdzie się tuż pod krawędzią.
- Opłucz jajka przez 2,5 minuty. Okresowo ponownie zawieszaj jaja, przesuwając tuleję w górę iw dół w roztworze podchlorynu za pomocą kleszczy.
- Przenieść tuleję bezpośrednio do drugiego pojemnika na próbkę, wstępnie napełnionego 90 ml wybielacza, wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego.
- Powtórz krok 1.3 w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Pod koniec drugiego wybielacza jaja powinny zacząć przylegać do boków tulei.
- Wykonaj kroki 1.7-1.8 w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
- Wyrzuć wybielacz i umyj tuleję sterylną wodą 3 razy. Kilkakrotnie ponownie zawieś jajka podczas każdego mycia, przesuwając tuleję kleszczami. Pod koniec trzeciego mycia większość jaj powinna być przymocowana do boku tulei.
- Za pomocą pędzla wysterylizowanego w etanolu przenieś jaja z boku tulei na sterylną dietę. Przenoś jaja pojedynczo lub w małych partiach. Staraj się o 30-50 jaj w fiolce. Pozostaw nakrętki luźne, aby tlen mógł dostać się do rurki. Jeśli fiolki mają pozostać aksoniczne, należy je przenieść do inkubatora dla owadów; W przeciwnym razie dodaj bakterie, jak poniżej.
2. Wytwarzaj muchy gnotobiotyczne przy użyciu 4 gatunków bakterii
- Przygotuj bakterie
- Przygotuj wysterylizowaną szafkę bezpieczeństwa biologicznego z niezbędnymi materiałami (pipety, pudełka na końcówki do pipet, wysterylizowane probówki wirówkowe, bulion MRS i stojaki na probówki), jak w kroku 1.1. Wytrzyj zewnętrzną część probówek chusteczką laboratoryjną nasączoną etanolem przed umieszczeniem w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
- Osadzaj bakterie, najpierw przenosząc 500 μl nocnego wzrostu do sterylnej probówki do mikrofuge. Jeśli gęstość bakterii jest niska, dodaj do 1,5 ml do każdej probówki lub sekwencyjnie usuń supernatant i dodaj dodatkową kulturę do tej samej probówki. Wyjąć próbki z komory bezpieczeństwa biologicznego i wirować przez 10 minut przy 10 000 x g. Używaj końcówek filtrujących, aby uniknąć zanieczyszczenia między próbkami.
- Określ gęstość każdej kultury, mierząc OD600. W przypadku korzystania z czytnika płytek wielodołkowych przenieść 200 μl każdej kultury na płytkę 96-dołkową w 1-, 2- i 4-krotnych rozcieńczeniach.
- Określić ilość mMRS, w której należy rozcieńczyć każdą osadę komórkową (2.1.2) za pomocą spektrofotometru do odczytu płytki i następujących równań. Zaplanuj dodanie wystarczającej ilości bulionu, aby zaszczepić 50 μl do każdej fiolki muchowej.
- Zbierzodczyty OD 600 dla rozcieńczenia 1:1, 1:2 i 1:4 każdej kultury bakteryjnej na spektrofotometrze z odczytem płytki. Wybrać rozcieńczenie dla każdego szczepu bakteryjnego, który wytwarza wartość OD600 między 0,1 a 0,2 i zastosować tę wartość i odpowiadający jej współczynnik rozcieńczenia jako "O" i "D" we wzorach podanych w ppkt 2.1.4.2 lub 2.1.4.3.
- W przypadku korzystania z 4 opisanych tutaj gatunków, znormalizuj komórki do równoważnej gęstości jednostki tworzącej kolonię (CFU)/ml (konwersja OD600 do CFU określona wcześniej w Newell i Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) przy użyciu tego równania:
E = ((O-B) x V x D)/C
gdzie E = objętość do ponownego zawieszenia osadu w (μl), O = OD600 bakterii, B = OD600 ślepej pożywki, D = krotne rozcieńczenie, V = μl kultury bakteryjnej przed odwirowaniem, C = OD600 o ustalonej stałej. Zobacz Plik kodu uzupełniającego, aby zapoznać się z przykładami obliczeń przy użyciu tych równań. W przypadku spektrofotometrów, które automatycznie się wyłączają, należy użyć "O" zamiast "O-B".
UWAGA: Z góry określone stałe (jednostki OD600, znormalizowane do 107 CFU ml-1, stałe wyprowadzone w Newell i Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) są następujące: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
- W przypadku stosowania innych gatunków bakterii (brak stałej CFU/OD600), znormalizuj gęstość do OD600 = 0,1, używając tego równania:
E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD600
UWAGA: Jednostki są takie same jak w kroku 2.1.4.2. Zobacz Plik kodu uzupełniającego, aby zapoznać się z przykładami obliczeń przy użyciu tych równań.
- W komorze bezpieczeństwa biologicznego usunąć supernatant za pomocą końcówki pipety i ponownie zawiesić osad w świeżym mMRS lub PBS, jak obliczono w kroku 2.1.4.2.
- Zaszczepić bakterie
- Przenieś 50 μl bakterii do stożkowych probówek ze sterylną dietą i zdekorionowanymi jajami w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodaj bakterie po przeniesieniu jaj, aby zapobiec zanieczyszczeniu między fiolkami.
- Umieścić zaszczepione probówki w inkubatorze w temperaturze 25 °C.
3. Zmierz obciążenie CFU/Test na sterylność
- Aby zmierzyć obciążenie CFU w homogenatach much całego ciała, przenieś 5 much (5-7 dni po eklacji) do probówki o pojemności 1,7 ml zawierającej 125 μl kulek ceramicznych i 125 μl bulionu mMRS. Homogenizować muchy za pomocą homogenizatora tkankowego przez 30 sekund z prędkością 4,0 M/s.
- Alternatywnie pomiń kulki i ręcznie homogenizuj w probówkach do mikrowirówek z plastikowymi tłuczkami przez 1 minutę.
- W przypadku ilościowego określania mikrobioty jelitowej należy wysterylizować muszki powierzchniowo, aby usunąć drobnoustroje egzogenne. Przenieść muchy do probówki mikrowirówkowej zawierającej 100 μl 70% etanolu na 1 minutę, odessać etanol i przenieść do nowej probówki do mikrowirówki w celu homogenizacji. Jeśli będzie mierzona zawartość DNA w jelitach, przed płukaniem etanolem należy płukać przez 1 minutę 0,6% podchlorynem sodu.
- Rozcieńczyć homogenat 875 μl mMRS, wirować przez 5 sekund i odpipetować 120 μl homogenatu do pierwszego dołka płytki do mikromiareczkowania.
- Wykonać dwa sekwencyjne rozcieńczenia 1:8 przy użyciu 10 μl homogenatu i 70 μl MRS w dwóch następnych studzienkach.
- Usunąć 10 μl z pierwszego dołka i dodać go do drugiego dołka zawierającego 70 μl MRS. Dokładnie wymieszać zawartość drugiego dołka, przenieść 10 μl z drugiego dołka do trzeciego dołka zawierającego 70 μl MRS i dokładnie wymieszać. Prowadzi to do 3 całkowitych stężeń oryginalnego homogenatu o objętości 1 000 μl: nierozcieńczonego, 1:8 i 1:64.
- Przenieść 10 μl każdego rozcieńczenia na płytkę mMRS (w razie potrzeby używając pipety wielokanałowej). Lekko pochyl naczynie, aby rozprowadzić rozcieńczenie kilka milimetrów po powierzchni agaru i pozwól płynowi wyschnąć przed przesunięciem płytki. Płyn szybko wysycha na talerzu, jeśli płytki mają 2 dni, zmniejszając mieszanie się dwóch sąsiednich kropel.
- Inkubować w temperaturze 30 °C przez 1-2 dni. Wyjmij płytki z inkubatora, gdy są wyraźne, widoczne są poszczególne kolonie i policz od rozcieńczenia z 10-100 izolowanymi koloniami.
- Obliczyć jtk na muchę, korzystając z równania E = C x D/P x V/F, gdzie E = jtk na muchę, C = liczba zliczonych kolonii, D = rozcieńczenie, P = μl platerowane, V = objętość homogenatu muchy, a F = liczba homogenizowanych much.