$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest zaczerpnięty z Radford and McKim, Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).
UWAGA: Procedury są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Inkubatory z kontrolowaną temperaturą służą do utrzymywania temperatury podczas chowu much i krzyżówek, chyba że zaznaczono inaczej.
1. Przygotowania
- Przygotuj muchy.
- Kolekcje oocytów wzbogacone prometafazą.
- Wyraźne dorosłe muchy ze zdrowych, młodych stad lub kultur krzyżowych. Butelki leżakowane przez dwa dni w temperaturze 25 °C.
UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, wystarczą dwie zdrowe butelki, chociaż w przypadku niektórych kultur może być potrzebnych więcej.
- Po dwóch dniach zbierz z butelek ~100 do 300 samic (które w tym momencie mają od 0 do 2 dni) z butelek. Kobiety nie muszą być dziewicami. Dodaj odrobinę pasty drożdżowej z boku fiolki i umieść 30 samic i 10 do 15 mężczyzn w fiolkach z drożdżami. Fiolki do leżakowania przez dwa dni w temperaturze 25 °C.
- Kolekcje oocytów wzbogacone metafazą.
- Zbierz od ~100 do 300 samic z hodowli lub krzyżówek. Dodaj odrobinę pasty drożdżowej z boku fiolki i umieść po 30 samic (bez dodatku samców) w fiolkach z drożdżami. Fiolki leżakujące przez trzy do pięciu dni w temperaturze 25 °C.
- Przygotuj roztwory.
UWAGA: Roztwory można przechowywać przez czas nieokreślony w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
- Przygotuj zmodyfikowany bufor Robba (5x): 500 mM HEPES, 500 mM sacharozy, 275 mM octan sodu, 200 mM octan potasu, 50 mM glukoza, 6 mM chlorek magnezu i 5 mM chlorek wapnia. Użyj 10 N 11:8 wodorotlenku sodu: wodorotlenek potasu, aby doprowadzić pH do 7,4. Sterylizować przez filtrację; Nie sterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrozić w razie potrzeby, aby przygotować ~200 ml preparatu 1x Robb's na oocyt.
- Rozwiązania mocujące.
- Opcja #1: Przygotuj utrwalanie formaldehydu/heptanu. Przygotuj bufor utrwalający: 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) plus 150 mM sacharozy. Aby użyć, przygotuj świeżość za pomocą 687,5 μl buforu utrwalającego i 312,5 μl 16% formaldehydu na oocyt prep.
ostrożność: Nosić rękawiczki podczas używania roztworów formaldehydu w dygestorium. Utylizuj odpady zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
- Opcja #2: Przygotuj utrwalanie formaldehydu/kakodylanu. Przygotuj Fix Mix: 250 mM sacharozy, 100 mM octanu potasu (pH 7,5), 25 mM octanu sodu (pH 7,0) i 25 mM EGTA (pH 8,0). Aby użyć, przygotuj świeże z 400 μl Fix Mix, 100 μl kakodylanu potasu (1 M, pH 7,2) i 500 μl 16% formaldehydu na oocyt prep.
ostrożność: Kakodylan potasu zawiera arsen.
- Przygotuj PBS/Triton X-100: 1x PBS plus 1% lub 0,05% Triton X-100. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przygotuj PBS-Tween 20-albuminę surowicy bydlęcej (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w/v) i 0,1% Tween-20. Może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez jeden tydzień.
2. Zbiór oocytów Drosophila w późnym stadium
- Ponieważ oocyty Drosophila z nienaruszonymi błonami przyklejają się do plastiku i szkła, należy wstępnie pokryć wnętrze jednej probówki o pojemności 5 ml i jednej pipety Pasteura na preparat oocytów PTB.
- Znieczulij wszystkie ~100 do 300 drożdżaków muchowych dwutlenkiem węgla i dodaj do blendera zawierającego ~100 ml 1x Robb's Buffer. Pulsuj trzy razy (~1 sekunda każdy). Trzymaj oocyty w Robb's przez <20 minut, aby uniknąć aktywacji.
UWAGA: Alternatywnie, oocyty mogą być ręcznie preparowane od samic. Zaletą tej metody jest to, że wymaga mniej samic. Należy jednak zadbać o to, aby ograniczyć narażenie na dwutlenek węgla do zaledwie kilku minut, aby uniknąć artefaktów związanych z niedotlenieniem.
- Przefiltrować przez duże oczka (~1,500 μm) do zlewki o pojemności 250 ml, aby usunąć duże części ciała. Jeśli na siatce pozostało wiele nienaruszonych brzuchów, ponownie zmiel materiał za pomocą dodatkowego bufora Robba i ponownie przefiltruj. Pozostaw na ~ 2 minuty, a następnie odessaj górną warstwę, usuwając jak najwięcej dużych części ciała.
- Przefiltrować przez małe oczka (~300 μm) do zlewki o pojemności 250 ml. Wypłucz pozostałe oocyty z pierwszej zlewki za pomocą dodatkowej pipety Robba i powlekanej pipety Pasteura. Niech się uspokoi ~ 3 min; oocyty ulegną ustabilizowaniu. Odessać wszystko oprócz ~10 ml.
- Wlej tyle 10 ml, ile zmieści się w powlekanej tubce o pojemności 5 ml. Pozostaw do osadzenia, usuń płyn i powtórz z pozostałą częścią. Wypłucz pozostałe oocyty ze zlewki za pomocą dodatkowej pipety Robba i powlekanej pipety Pasteura. Pozostaw w probówce o pojemności 5 ml na ~ 3-5 minut.
3. Leczenie farmakologiczne (opcjonalnie)
- Pokryj drugą probówkę o pojemności 5 ml PTB dla każdego preparatu oocytów. Dodaj odpowiedni rozpuszczalnik (kontrola) lub lek do 1 ml Robb's każdy na każdy preparat oocytów (Tabela 1).
- Podziel oocyty na drugą powlekaną probówkę o pojemności 5 ml. Pozostaw do spoczynku, usuń płyn i dodaj 1 ml rozpuszczalnika Robb's plus do jednej probówki i 1 ml leku Robb's plus do drugiej probówki. Nutian przez odpowiedni czas do leczenia farmakologicznego (Tabela 1). Niech się uspokoi.
4. Fiksacja
- Odessać cały płyn i natychmiast dodać 1 ml Fix.
- Opcja #1: Utrwalanie formaldehydu/heptanu (bufor utrwalający plus 5% formaldehydu).
- Mocuj przez 2,5 minuty na nutatorze. Dodaj 1 ml heptanu i wiruj 1 min. Odstawić ~1 min.
- Usuń cały płyn, a następnie dodaj 1 ml 1x PBS. Wir 30 sek. Odstawić ~1 min.
- Usuń cały płyn, a następnie napełnij probówkę 1x PBS.
UWAGA: Oocyty mogą być wykorzystane natychmiast lub przechowywane na nutatorze przez kilka godzin w temperaturze pokojowej.
- Opcja #2: Utrwalanie formaldehydu/kakodylu (Fix Mix plus 8% formaldehydu i 100 mM kakodylatu).
- Fix przez 6 minut na nutatorze. Odstaw na 2 minuty. Usuń płyn, a następnie napełnij probówkę 1x PBS.
UWAGA: Oocyty mogą być wykorzystane natychmiast lub przechowywane na nutatorze przez kilka godzin w temperaturze pokojowej.
5. Usuwanie membran ("Rolling")
- Używając powlekanej pipety Pasteura, dodaj ~500 do 1,000 oocytów do matowej (piaskowanej) części szkiełka podstawowego. Usuń wszystkie części ciała i obce materiały za pomocą kleszczy. Nie pozwól, aby oocyty wyschły; dodaj 1x PBS w razie potrzeby.
- Umieść szkiełko nakrywkowe na oocytach i delikatnie "zwijaj" oocyty, aż wszystkie błony zostaną usunięte (najlepiej sprawdza się przeciąganie krawędzi szkiełka nakrywkowego po oocytach). Okresowo sprawdzaj postęp pod mikroskopem, dodając w razie potrzeby więcej 1x PBS. Uważaj, ponieważ zbyt duży nacisk zniszczy oocyty.