Przygotowanie utrwalonych oocytów Drosophila do barwienia immunologicznego: wysokoprzepustowa metoda utrwalania i usuwania błony zewnętrznej

Streszczenie

Źródło: Radford, S. J., McKim, K. S. Techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila. J. Vis. Exp. (2016).

Barwienie immunologiczne oocytów Drosophila w późnym stadium może okazać się trudne ze względu na otaczające je błony. Ten film opisuje wysokoprzepustową metodę pozyskiwania oocytów, ich utrwalania i usuwania błon w celu barwienia immunologicznego. Przedstawiony protokół demonstruje te techniki z oocytami w późnym stadium używanymi do wizualizacji różnych etapów mejozy.

Protokół

Ten protokół jest zaczerpnięty z Radford and McKim, Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).

UWAGA: Procedury są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Inkubatory z kontrolowaną temperaturą służą do utrzymywania temperatury podczas chowu much i krzyżówek, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Przygotowania

1. Przygotuj muchy.
   1. Kolekcje oocytów wzbogacone prometafazą.
      1. Wyraźne dorosłe muchy ze zdrowych, młodych stad lub kultur krzyżowych. Bute....

Wyniki

lek	rozpuszczalnik	Koncentracja zapasów	Końcowe stężenie	Czas zabiegu	efekt
kolchicyna	etanol	125 mM	150 μM	10 min lub 30 min	Destabilizacja niekinetochoru (10 min) lub wszystkie.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
16% formaldehydu	Ted Pella, Inc.	Numer katalogowy: 18505	NIEBEZPIECZNE; po otwarciu wyrzucić po miesiącu
Zlewki 250 ml	rozmaity
Probówki 5 ml	rozmaity
aktywne suche drożdże	rozmaity		Wymieszaj z wodą, aby uzyskać pastę o konsystencji masła orzechowego
Binukleina 2	Sigma	Zobacz materiał B1186	niebezpieczny
Blender	rozmaity
albumina surowicy bydlęcej	Sigma	Nr kat. A4161
chlorek wapnia	rozmaity
kolchicyna	Sigma	Silnik C-9754	niebezpieczny
Szkiełka nakrywkowe	Firma VWR	Numer telefonu 48366-227	Nr 1 1/2
Dmso	rozmaity
EGTA (EGTA)	rozmaity
etanol	rozmaity
Kleszcze	Ted Pella, Inc.	Numer katalogowy: 5622	Pęseta Dumont o wysokiej precyzji gatunek 5
Szkiełka szklane	Firma VWR	Numer telefonu 48312-003
glukoza	rozmaity
HEPESY	Firma VWR	EM-5330	Dostępne u kilku sprzedawców
chlorek magnezu	rozmaity
duże oczka (~1,500 μm)	Firma VWR	AA43657-NK	różnorodność formatów i innych dostawców, 12 lub 14 oczek
małe oczka (~300 μm)	Laboratoria widma	146 424	różnorodność formatów, np. 146 422 lub 146 486
Nutator	rozmaity
Pipety Pasteura	rozmaity
octan potasu	rozmaity
Kwas kakodylowy	Sigma	Zobacz materiał C0125	NIEBEZPIECZNE; alternatywnie można zastąpić go kakodylanem sodu
wodorotlenek potasu	rozmaity
octan sodu	rozmaity
wodorotlenek sodu	rozmaity
sacharoza	rozmaity
Taksol (paklitaksel)	Sigma	Zobacz materiał T1912	niebezpieczny
Tryton X-100	rybak	Przekaźnik PI-28314
Animacja 20	rybak	Przekaźnik PI-28320
wir	rozmaity

powiedział: