$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem artykułu Perkinsa i Bickela, Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017).
1. Usuwanie kosmówki i błon witelinowych
UWAGA: Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się z potrzebnymi narzędziami.
- Oddziel oocyty w późnym stadium rozwoju
- Dodaj 1 ml PBSBTx do płytkiego naczynia preparacyjnego. Użyj P200 z końcówką pokrytą BSA, aby przenieść nieruchome jajniki (w ~150 μl) do płytkiego naczynia. Pipetuj jajniki w górę i w dół za pomocą końcówki pipety pokrytej BSA, aby usunąć dojrzałe oocyty ze mniej dojrzałych oocytów.
- Gdy oocyty w późnym stadium są wystarczająco oddzielone, przenieś całą tkankę do probówki do mikrofuge o pojemności 500 μl. Nadmiar płynu usunąć za pomocą ciągniętej pipety Pasteura, pozostawiając w probówce około 150 - 200 μL. Powtórzyć sekcję 1.1 dla pozostałych genotypów.
- Przygotuj się do walcowania
- Wstępnie zwilż naczynie z głęboką studnią z 200 μl PBSBTx. Przykryj i odstaw na bok. Zdobądź 3 szkiełka z matowego szkła i odłóż zjeżdżalnię #3 na bok. Delikatnie pocieraj o siebie obszary matowego szkła szkiełek #1 i #2. Opłucz je w wodzie dejonizowanej, aby usunąć wszelkie odłamki szkła i osusz jednorazową chusteczką.
- Pokryj oszronione obszary szkiełek #1 i #2 PBSBTx, dodając 50 μl PBSBTx do jednego szkiełka i pocierając ten obszar drugim szkiełkiem. Usuń płyn jednorazową chusteczką.
- Umieść szkiełka pod mikroskopem preparacyjnym w konfiguracji pokazanej na Rysunek 2A. Utrzymuj oszronione obszary slajdów #1 i #2 w kontakcie, ze slajdem #3 podtrzymującym slajd #2.
- Zwijaj oocyty; upewnij się, że kierunek toczenia jest zawsze w linii prostej, a nigdy w ruchu okrężnym.
- Wstępnie zwilż końcówkę pipety P200 w PBSBTx i rozproszyj oocyty w probówce do mikrofuge, pipetując w górę iw dół. Przenieś 50 μl płynu zawierającego oocyty na środek matowej szklanej części szkiełka #1. Podnieś zjeżdżalnię #2, aby to zrobić.
- Powoli opuść suwak #2, aż napięcie powierzchniowe cieczy utworzy uszczelnienie między dwoma obszarami z matowego szkła. Powinno być wystarczająco dużo płynu, aby pokryć oszroniony obszar, ale żaden nie powinien wyciekać. Jeśli płyn jest przepełniony, użyj wyciągniętej pipety Pasteura, aby usunąć nadmiar płynu.
- Przytrzymaj dolną prowadnicę (#1) na miejscu jedną ręką, a drugą ręką przesuń górną prowadnicę (#2) do przodu iz powrotem w kierunku poziomym, utrzymując suwak #2 poziomo i podparty na slajdzie #3. Wykonuj pod mikroskopem, aby łatwo zobrazować ruchy i postępy oocytów.
UWAGA: Ten ruch wygeneruje tarcie i spowoduje, że oocyty "przewrócą się" i stracą kosmówkę. Należy stosować minimalny nacisk, a ruchy powinny być krótkie i szybkie.
- Po kilku ruchach w kierunku poziomym nieznacznie zmień kąt ruchu (Rysunek 2B). W wielu krokach stopniowo zwiększaj ten kąt do 90°, aż ruch górnego suwaka będzie prostopadły do kierunku początkowego (Rysunek 2B). Należy pamiętać, że puste kosmówki będą widoczne w płynie, a oocyty pozbawione kosmówki będą wydawać się dłuższe i cieńsze.
- Powtórz kroki 1.3.3 - 1.3.4 około 7 - 10 razy, aż roztwór stanie się lekko mętny. Przestań się toczyć, gdy wydaje się, że większość oocytów (75 - 85%) utraciła błony żółciowe.
UWAGA: Charakterystyczny spiczasty koniec jest często widoczny na oocytach pozbawionych błon witelinowych. Błony witelinowe są trudniejsze do usunięcia niż kosmówka. Podczas walcowania można wywierać lekki nacisk na górny suwak (slajd #2) w celu usunięcia membran witelinowych. Próba usunięcia błon witelinowych ze wszystkich oocytów często kończy się zniszczeniem innych oocytów.
- Delikatnie podnieś górny slajd (#2), przeciągając jeden z jego rogów do środka oszronionego obszaru dolnego zjeżdżalni (#1) tak, aby zwinięte oocyty gromadziły się w środku oszronionego obszaru. Przepłukać oocyty z obu szkiełek za pomocą PBSBTx do naczynia głębinowego zawierającego PBSBTx.
- Wyczyść szkiełka #1 i #2 ultraczystą wodą, osusz jednorazową chusteczką i zresetuj. Powtarzać kroki 1.3.1 - 1.3.6, aż wszystkie oocyty o tym samym genotypie zostaną zrolowane. Zwykle wymaga to 3-4 rund walcowania na genotyp.
- Usuń zanieczyszczenia po walcowaniu
- Dodaj 1 ml PBSBTx do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Zakręć płynem, aby pokryć boki tuby.
- Za pomocą końcówki do pipety P1000 pokrytej PBSBTx przenieś zwinięte oocyty z naczynia głębinowego do stożkowej probówki zawierającej 1 ml PBSBTx. Dodać dodatkowe 2 ml PBSBTx do stożkowej probówki zawierającej oocyty.
- Pozwól oocytom zacząć osiadać na dnie, a następnie usuń górne 2 ml roztworu zawierającego zanieczyszczenia (kosmówki, żółciówki itp.) za pomocą P1000 i wyrzuć. W razie potrzeby przytrzymaj stożkową rurkę na ciemnym tle, aby zobaczyć nieprzezroczyste oocyty, gdy toną.
- Dodaj dodatkowe 2 ml PBSBTx do oocytów i powtórz krok 1.4.3. Powtórzyć czynności 1.4.3. w sumie 3 rundy usuwania gruzu.
- Używając końcówki pipety P1000 z powłoką PBSBTx, przenieś oocyty z powrotem do oryginalnej probówki mikrofuge o pojemności 500 μl. 20 - 25 samic powinno dać około 50 μl zwiniętych dojrzałych oocytów.
- Powtórzyć sekcję 4 dla pozostałych genotypów, używając świeżych, oszronionych szkiełek, czystego naczynia z głęboką studzienką i nowej stożkowej rurki dla każdego genotypu.
- Jeśli konieczne jest przechowywanie, przenieś oocyty do 1x PBS z 0,1% TritionX-100 i przechowuj przez noc w temperaturze 4 °C. Nie zaleca się długotrwałego przechowywania, ponieważ sieciowanie formaldehydu może zostać odwrócone przez detergenty niejonowe.
