Przerwanie naskórka: metoda zbierania hemolimfy z larw Drosophila

Streszczenie

Źródło: Reimels, T. A. i Pfleger, C. M. Metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw Drosophila. J. Vis. Exp. (2016).

Molimimfa Drosophila służy zarówno jako krew, jak i płyn śródmiąższowy, krążąc po całym ciele podczas stadium larwy i dorosłego osobnika. Ten film opisuje protokół pobierania larw hemolimfy w celu ilościowego określenia krążących komórek.

Protokół

Ten protokół jest fragmentem z Reimelsa i Pflegera, Metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw Drosophila, J. Vis. Exp.(2016).

1. Stężenie hemocytu w krążeniu

1. Aby uzyskać larwy o mniej więcej tym samym etapie rozwoju dla tego testu, należy ograniczyć zbieranie jaj, pozwalając samicom na składanie jaj przez określony czas 2 - 6 godzin.
2. Zbierz larwy w dołkach preparacyjnych wypełnionych 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
3. Dla każdej larwy umieścić 10 μl 1x PBS w probówce do mikrowirówki na lodzie i 10 μl 1x PBS na czystej podkładce preparucyjnej. Umieść podkładkę sekcyjną na podświetlanej podstawie mikroskopu stereoskopowego.
4. Osusz pojedynczą larwę, umieszczając ją na chusteczce higienicznej przed przeniesieniem jej do kropli PBS na podkładce do sekcji.
5. Za pomocą kleszczy delikatnie rozerwij i ostrożnie odwróć naskórek, aby uwolnić hemolimfę.
   UWAGA: Uważaj, aby nie zeskrobać ani nie dźgnąć naskórka, ponieważ może to potencjalnie uwolnić siedzące hemocyty.
6. Za pomocą pipety zbierz hemolimfę z podkładki preparacyjnej. Unikaj zbierania resztek larw, takich jak ciało tłuszczowe.
7. Dodaj hemolimfę do probówki do mikrowirówki i mieszaj, pipetując w górę iw dół.
   UWAGA: Można pobrać kilka próbek jednocześnie i przechowywać je na lodzie przez okres do godziny.
8. Opcjonalnie: Wymieszaj błękit trypanowy z próbką hemolimfy w równych częściach, aby zabarwić i wykluczyć martwe komórki. Policz komórki w ciągu 3 minut od dodania błękitu trypanowego, ponieważ jest on toksyczny dla komórek.
9. Wymieszać próbkę, pipetując w górę i w dół, a następnie umieścić 10 μl w komorze hemocytometru.
10. Jeśli używasz automatycznego licznika komórek, ustaw odpowiednie parametry dla rozmiaru komórki i obiegu. Na przykład ustaw minimalny rozmiar komórki 2 μm, maksymalny rozmiar komórki 22 μm i okrągłość 75 - 80%, aby wykryć normalne, okrągłe hemocyty. Eksperymentuj z różnymi parametrami, aby wykryć większe i wrzecionowate hemocyty, takie jak lamellocyty. Alternatywnie użyj hemocytometru do ręcznego liczenia hemocytów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tabletki PBS	MP Biomedycyna	2810305
naczynie preparacyjne	Corning	7220-85
Probówka do mikrowirówek	Denville	Zobacz materiał C2170
silikonowa podkładka preparacyjna, wykonana z zestawu Sylgard 184	Krayden (dystrybuowany przez Fisher)	NC9644388 (numer katalogowy Fisher)	Wykonany na szalce Petriego poprzez zmieszanie składników zestawu elastomeru Sylgard zgodnie z instrukcjami producenta.
mikroskop stereoskopowy	Morrell Instruments (dystrybutor firmy Nikon)	MNA42000, MMA36300	Modele Nikona SMZ1000 i SMZ645
chusteczki	Firma VWR	82003-820
Kleszcze	Nauki o mikroskopii elektronowej	72700-DZ
Pipeta P200	Eppendorf	3120000054
Hrabina Automatyczny licznik komórek	Invitrogen	Zobacz materiał C10227
Szkiełka komory zliczania komórek hrabiny	Invitrogen	Zobacz materiał C10283
hemocytometr	Hausser Scientific	3200
niebieska plama trypana	Technologie życiowe	Zobacz materiał T10282

higieniczne powiedział: szt.