Rozwarstwienie kompleksu oko-mózg z poczwarek much: metoda izolacji tkanki siatkówki

Abstract

Źródło: DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. Analiza siatkówki poczwarki Drosophila do celów immunohistochemicznych, analizy zachodniej i izolacji RNA. J. Vis. Exp.(2019).

Ten film opisuje, jak przeprowadzić sekcję i wyizolować kompleks oko-mózg od poczwarek Drosophila. Przedstawiony protokół pokazuje, że procedura pozwala uzyskać wysokiej jakości tkankę, kompatybilną na przykład z barwieniem immunologicznym, a także innymi eksperymentami z ekspresją genów.

Protocol

Ten protokół jest fragmentem DeAngelisa i Johnsona, Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation, J. Vis. Exp.(2019).

1. Przygotowanie tkanek

1. Ustaw krzyżówki Drosophila (jak opisano wcześniej w Greenspan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)) lub szczepy Drosophila specyficzne dla hodowli, aby uzyskać poczwarki o pożądanym genotypie. Aby upewnić się, że duża liczba poczwarek pojawi się przypadkowo, należy założyć te kultury much w dwóch egzemplarzach na bogatych w składniki odżywcze pożywkach spożywczych lub standardowych pożywkach spożywczych obficie uzupełnionych pastą drożdżową.
2. Utrzymuj kultury Drosophila w temperaturze 25 °C. W przypadku krzyżówek wykorzystujących system UAS-GAL4, GMR-GAL4 jest idealnym sterownikiem ulegającym ekspresji w komórkach krążka larwalnego oka za bruzdą morfogenetyczną i przez cały okres rozwoju poczwarki. Krzyżówka UAS-lacZ X GMR-GAL4 służy jako idealna krzyżówka kontrolna, ponieważ napędza ekspresję nieendogennego i obojętnego białka β-galaktozydazy.
3. Użyj końcówki 6-calowej szyny bambusowej, która została zwilżona wodą destylowaną, aby delikatnie podnieść białe poczwarki (Rysunek 1B) z boku zdrowych fiolek hodowlanych (Rysunek 1A) i umieść w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml ( Rysunek 1C).
4. Umieść probówki w plastikowym pudełku z końcówkami do pipet wraz z małym kawałkiem chusteczki nasączonej wodą destylowaną, aby utrzymać komorę w wystarczającej wilgotności, aby chronić poczwarki przed wysuszeniem (Rysunek 1D). Inkubować poczwarki w temperaturze 25 °C aż do rozbiorów.
5. Użyj suchej 6-calowej szyny bambusowej, aby delikatnie wypchnąć poczwarki z probówki mikrowirówki na czarną miskę sekcyjną. Połóż świeży kawałek taśmy dwustronnej na naczyniu preparacyjnym z dala od poczwarek.
6. Używając pary kleszczy, ostrożnie umieść poczwarki grzbietową stroną do góry (tj. wieczkami skierowanymi do góry, Rysunek 1B) na taśmie (Rysunek 2A). Upewnij się, że poczwarki dobrze przylegają do taśmy.
   UWAGA: Wilgoć na opakowaniu poczwarki utrudni bezpieczne przyleganie do taśmy, w takim przypadku należy pozwolić poczwarkom wyschnąć na powietrzu przed umieszczeniem na taśmie dwustronnej.

2. Sekcja kompleksów oko-mózg

1. Użyj kleszczy, aby usunąć wieczko z każdej poczwarki (Rysunek 2C).
2. Użyj nożyczek do mikrodysekcji, aby pokroić lub rozciąć skrzynkę poczwarki każdej poczwarki. Otwórz klapę koperty poczwarki, aby odsłonić głowę, klatkę piersiową i przedni segment brzuszny, mocując krawędzie koperty poczwarki do dwustronnej taśmy (Rysunek 2C).
   UWAGA: Nie jest konieczne całkowite odsłanianie poczwarek.
3. Przebij brzuch każdej poczwarki ostrymi kleszczami, aby chwycić zwierzę i wyjmij je z etui poczwarki (Rysunek 2C).
4. Umieścić poczwarki na czarnym naczyniu preparacyjnym, z dala od taśmy, i zalać około 400 μl lodowatego roztworu buforowanego fosforanem (PBS, pH 7,4).
5. Chwyć każdą poczwarkę za brzuch kleszczami, a nożyczkami do mikrodysekcji wykonaj czyste cięcie w przekroju poprzecznym przez całą klatkę piersiową, przecinając poczwarkę na pół (Rysunek 2D).
6. Usunąć tylną resztkę każdej tuszy z PBS i odłożyć na bok na szalce do rozwarstwiania (nie wyrzucać, patrz krok 3.2.1).
7. Używając dwóch par cienkich kleszczyków, otwórz klatkę piersiową i głowę każdej poczwarki, aby odsłonić kompleks oko-mózg (Rysunek 2E). Aby to zrobić, chwyć przecięte krawędzie nabłonka klatki piersiowej i stopniowo rozrywaj, aby otworzyć klatkę piersiową, a następnie torebkę głowy, odsłaniając kompleks oko-mózg i otaczającą tkankę tłuszczową.
8. Nie chwytając tkanki, użyj kleszczy, aby skierować kompleks oko-mózg z dala od resztek torebki głowy lub zgarnij kompleks oko-mózg z rozerwanej torebki głowy.
   UWAGA: Kompleks oko-mózg ma kształt hantli, jest białawy i bardziej przezroczysty niż otaczający go kremowy tłuszcz (Rysunek 2B,E).
9. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń większość tłuszczu związanego z kompleksami oko-mózg bez dotykania tkanki oka.

3. Przetwarzanie tkanek do immunofluorescencji

1. Rozetnij co najmniej 6-10 poczwarek zgodnie z opisem (kroki 2.1-2.9).
   UWAGA: Trzy do czterech niezależnych powtórzeń każdej sekcji zwykle dostarcza wystarczających danych do przetestowania hipotezy.
2. Mycie i utrwalanie
   1. Odetnij końcówkę końcówki pipety P20 lub P100 czystą żyletką, aby zwiększyć otwór końcówki do promienia ~1 mm i nasmaruj, pipetując mieszaninę PBS i tłuszczu w górę iw dół. Tłuszcz ten można uzyskać z resztek tuszy usuniętych w kroku 2.6.
   2. Przenieś kompleksy oko-mózg do ~400 μl PBS w 9-dołkowym szklanym naczyniu na lodzie. Do przenoszenia użyj nasmarowanej końcówki i mikropipety wyporowej P20 lub P100 do przenoszenia.
      UWAGA: Kompleksy oko-mózg przylegają do niesmarowanych końcówek podczas pipetowania i ulegają uszkodzeniu lub zgubieniu.
   3. Usuń pozostały tłuszcz związany z tkanką oka, pipetując PBS w górę iw dół, aby delikatnie zawirować kompleksy oko-mózg. W tym i wszystkich kolejnych etapach mycia nie należy bezpośrednio pipetować kompleksów oko-mózg w górę i w dół, ponieważ spowoduje to uszkodzenie delikatnej tkanki oka.
   4. Przenieść kompleksy oko-mózg w minimalnej objętości (<20 μl) PBS do co najmniej 250 μl utrwalacza. Mieszać, pipetując roztwór w górę i w dół. Inkubować przez 35 minut na lodzie.
      UWAGA: Do tego transferu można użyć tej samej nasmarowanej końcówki przygotowanej w kroku 3.1.1.
   5. Za pomocą tej samej końcówki pipety przenieś kompleksy oko-mózg do studzienki zawierającej ~400 μL PBS. Mieszać, pipetując roztwór w górę i w dół, a następnie inkubować przez 5-10 minut na lodzie do umycia. Powtórz krok prania co najmniej dwa razy.
      UWAGA: Kompleksy oko-mózg można utrzymywać przez kilka godzin w końcowym płukaniu PBS, na lodzie lub w temperaturze 4 °C, przed przejściem do kroku 3.3.1.
3. Barwienie przeciwciał
   1. Aby zablokować tkankę przed ekspozycją na roztwory przeciwciał, przenieś kompleksy oko-mózg do ~400 μl PBT. Do transferu należy użyć nasmarowanej końcówki i mikropipety wyporowej P20 lub P100. Inkubować przez 10 do 60 minut na lodzie.
   2. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczając odpowiednie przeciwciała w PBT. Ponieważ kompleksy oko-mózg inkubuje się w 10 μl podwielokrotności roztworu przeciwciała, przygotowana objętość będzie powtórzeniem 10.
   3. Podwielokrotność 10 μl roztworu przeciwciał do czystego dołka z 72-dołkową tacą mikrodołkową.
   4. Odetnij końcówkę końcówki pipety P10 czystą żyletką, aby zwiększyć otwór końcówki do promienia ~0,5 mm i nasmaruj, pipetując PBT w górę iw dół.
   5. Przenieść nie więcej niż 5 kompleksów oko-mózg w objętości <3 μl PBS do każdego 10 μl roztworu przeciwciała za pomocą mikropipety P10 wyporowej powietrza i nasmarowanej końcówki.
   6. Homogenizować roztwór przeciwciała, pipetując roztwór w górę iw dół. Nie pipetuj kompleksów oko-mózg w górę i w dół, ponieważ spowoduje to uszkodzenie tkanki.
   7. Aby zminimalizować parowanie roztworu przeciwciała, umieść mały kawałek tkanki nasączonej wodą destylowaną w tacce mikrostudzienki i zamknij tackę (np. za pomocą dostarczonej pokrywki). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
   8. Przenieś kompleksy oko-mózg z tacki mikrostudzienki do ~400 μl PBT w szklanym naczyniu z 9 dołkami, w celu umycia. Użyj mikropipety P10 z wyporem powietrza i końcówki smarowanej PBT (przygotuj zgodnie z opisem w kroku 3.3.4). Mieszać, pipetując roztwór w górę i w dół. Inkubować przez 5-10 minut na lodzie.
   9. Powtórz etap prania co najmniej dwa razy. Użyj mikropipety P20 lub P100 z wyporem powietrza i końcówki smarowanej PBT, aby przenieść kompleksy oko-mózg między roztworami myjącymi.
   10. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczając odpowiednie przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem w PBT, zgodnie z wymaganiami. 100 μl roztworu przeciwciała drugorzędowego jest wystarczające na partię 6-10 poczwarek. Podwielokrotność roztworu przeciwciał drugorzędowych umieścić w 9-dołkowym szklanym naczyniu preparacyjnym.
   11. Przenieś kompleksy oko-mózg do wtórnego roztworu przeciwciał. Do transferu należy użyć mikropipety wyporowej P20 lub P100 i końcówki smarowanej PBT.
   12. Kompleksy oko-mózg należy inkubować w wtórnym roztworze przeciwciał przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub 3-5 godzin w temperaturze 4 °C. Aby zapobiec bieleniu fluoroforów światłem, należy przykryć preparat folią.
       UWAGA: Optymalny czas inkubacji w roztworze przeciwciał drugorzędowych może się różnić w zależności od zastosowanych przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych.
   13. Przenieś kompleksy oko-mózg do ~400 μl PBT w 9-dołkowym szklanym naczyniu, aby umyć. Mieszać, pipetując roztwór w górę i w dół. Inkubować przez 5-10 minut na lodzie. Ten etap prania należy powtórzyć co najmniej dwa razy.
4. Wtórna fiksacja
   1. W celu wtórnego utrwalenia przenieść kompleksy oko-mózg do co najmniej 200 μl utrwalacza i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej lub 35 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Wtórne mocowanie usztywnia tkankę oka, co wspomaga montaż (krok 3.5).
   2. Użyj mikropipety wyporowej P20 lub P100 i końcówki smarowanej PBT, aby przenieść kompleksy oko-mózg do ~400 μl PBT w 9-dołkowym szklanym naczyniu, na lodzie, do mycia przez 5 minut.
   3. Powtórz krok prania co najmniej raz.
   4. Użyj mikropipety P20 lub P100 z wyporem powietrza i końcówki smarowanej PBT, aby przenieść kompleksy oko-mózg do ~400 μl PBS w 9-dołkowym szklanym naczyniu, na lodzie, do płukania przez 1-2 minuty. Utrzymuj tkankę w ruchu, pipetując PBS, ale nie tkankę, w górę iw dół, aby zapobiec osadzaniu się kompleksów oko-mózg i przyleganiu do szklanego naczynia podczas płukania PBS.
5. Montażu
   1. Przenieś kompleksy oko-mózg do ~200 μL podłoża montażowego. Użyj mikropipety wyporowej P20 lub P100 i końcówki smarowanej PBT, aby przenieść kompleksy oko-mózg. Pozwól chusteczce zrównoważyć się w podłożu montażowym przez 1-2 godziny.
   2. Umieść kroplę 5-8 μl świeżego podłoża montażowego na czystym szkiełku mikroskopowym.
   3. Wytnij końcówkę P10 czystą żyletką, aby zwiększyć otwór końcówki do promienia ~0,5 mm i użyj jej oraz mikropipety P10 z wyporem powietrza, aby przenieść kompleksy oko-mózg w 5-8 μl podłoża montażowego do kropli podłoża montażowego na szkiełku.
   4. Użyj dwóch igieł wolframowych, aby oddzielić oczy od płatów wzrokowych. Przypnij kompleks oko-mózg do szkiełka za pomocą solidnej wolframowej igły i odetnij każde oko od powiązanego płata wzrokowego za pomocą cienkiej wolframowej igły (Rysunek 2F).
   5. Za pomocą cienkiej igły wolframowej należy przesunąć każde oko do powierzchni szkiełka mikroskopowego tak, aby podstawowa powierzchnia każdego oka przylegała do szkiełka. Delikatnie opuść czysty szkiełko nakrywkowe na chusteczkę i zabezpiecz lakierem do paznokci.
      UWAGA: Ułożenie oczu na szkiełku tak, aby znajdowały się blisko siebie lub w linii, ułatwi późniejszą mikroskopię.
   6. Zobrazuj siatkówki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej.
      UWAGA: Preparaty należy przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli nie zostaną natychmiast zobrazowane.

Results

Rycina 1: Selekcja i hodowla poczwarek do sekcji. (A) Wędrujące larwy i poczwarki trzeciego stadium larwalnego (L3) lokalizują się wzdłuż boków zdrowych kultur Drosophila. (B) Poczwarki można zidentyfikować po ich półprzezroczystym białym kolorze, ponieważ pigment nie został jeszcze wytworzony w ochronnym etui poczwarki. Oś przednio-tylna i grzbietowo-brzuszna poczwarki jest po...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szyny bambusowe, 6"	Ted Pella Inc	Rozdział 116
miska preparcyjna			Szklana szalka Petriego wypełniona po brzegi SYLG170 lub SYLG184 (zabarwiona na czarno drobno zmielonym węglem drzewnym w proszku). Pozostawić w temperaturze pokojowej na 24-48 godzin do polimeryzacji.
Uchwyt ostrza	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 10053
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A7906
Taśma dwustronna	3 mln	665
Drosophila i pożywki spożywcze, bogate w składniki odżywcze			7,5% sacharozy, 15% glukozy, 2,5% agaru, 20% drożdży piwnych, 5% peptonu, 0,125% MgSO4,7H2O, 0,125% CaCl2,2H20
Drosophila i pożywki spożywcze, standardowe			Bloomington Drosophila Przepis na mąkę kukurydzianą w centrum bulionu. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Roztwór utrwalający			4% formadehydu w PBS, pH 7,4.
Kleszcze	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 91150-20	Kleszcze należy często ostrzyć.
Formaldehyd	Thermo Scientific	Numer katalogowy: 28908
Szklane naczynia 9-dołkowe	Corning	7220-85	Znane również jako naczynia 9-dołkowe
Szkiełka nakrywkowe szklane (22 x 22 mm)	Fisher Naukowy	12-542-B
Szkiełka podstawowe (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 12-550-413
Szklana szalka Petriego	Corning	3160-100BO
glicerol	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G5516
Probówki mikrowirówki	Axygen (Axigen	MCT-175-C
Nożyczki do mikrodysekcji	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 15000-03
Tacki z mikrostudzienkami (dołki 72 x 10 μl)	Nunc	438733
Nośniki montażowe			0,5% N-propylogalan i 80% glicerol w PBS
N-galusan propylu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P3130
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P5368	Przygotuj zgodnie z instrukcjami producenta
Pbt			0,15% TritonX i 0,5% albumina surowicy bydlęcej w PBS, pH 7,4
Uchwyt na sworzeń	Narzędzia naukowe	26016-12
Przeciwciało pierwszorzędowe: kozie anty-GAPDH	Szczepionka Imgenex	IMG-3073	Do Western blotting. Używany w 1:3000
Przeciwciało pierwszorzędowe: królik przeciw rozszczepieniu Dcp-1	Sygnalizacja komórkowa	Zobacz materiał 9578S	Do immunofluorescencji. Używany w 1:100
Przeciwciało pierwszorzędowe: szczurzy anty-DEcad	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	Kontroler DCAD2	Do immunofluorescencji. Używany w 1:20
Przeciwciało pierwszorzędowe: szczurzy anty-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	Kontroler DCAD1	Prezent od Tadashi Uemura. Używany w 1:100.
Ostrza skalpela	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 10050	Odłam mały kawałek ostrza scapel i zabezpiecz w uchwycie ostrza.
Przeciwciało drugorzędowe: 488-sprzężone z osłem anty-szczurze IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	Tel. 712-545-153	Do immunofluorescencji. Używany w 1:200
Przeciwciało drugorzędowe: anty-królicze IgG (H+L) sprzężone z cy3-kozią	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	111-165-144	Do immunofluorescencji. Używany w 1:100
Przeciwciało drugorzędowe: IgG (H+L) kozy sprzężonej z HRP	Technologia sygnalizacji komórkowej	Zobacz materiał 7077	Do Western blotting. Używany w 1:3000
Przeciwciało drugorzędowe: królicza anty-kozia IgG (H+L) sprzężona z HRP	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	305-035-003	Do Western blotting. Używany w 1:3000
Stereoskopowy mikroskop prosektoryjny (M60 lub M80)	Mikrosystemy Leica		lub podobny mikroskop
Sylgard ()	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (przezroczysty)	Dow Corning	SYLG184	Kolor z drobno zmielonym proszkiem charcol
Tkanka: Chusteczki Kimwipes	KIMTECH	Numer katalogowy: 34120
TrytonX	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T8787
Igła wolframowa, cienka	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 10130-10	Włóż do uchwytu na szpilki
Igła wolframowa, wytrzymała	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 10130-20	Włóż do uchwytu na szpilki
Pasta drożdżowa	(lokalny supermarket)		Około 2 łyżki drożdży Fleischmann's ActiveDry (lub podobnych) rozpuszczonych w ~20 ml destylowanego H2O