Drosophila Rozwarstwienie mięśni lotu pośredniego późnej poczwarki (IFM): metoda wysokoprzepustowego pobierania tkanek

Streszczenie

Źródło: Kao, S. Y., et al. Analiza mięśni lotu Drosophila melanogaster dla podejść omicznych. J. Vis. Exp. (2019).

Mięśnie lotu Drosophila są używane jako modelowy system dla rozwoju i fizjologii mięśni. Ten film opisuje muskulaturę lotu dorosłych osobników i przedstawia protokół analizy rozwijających się pośrednich mięśni lotu, które są odpowiednie do sekwencjonowania RNA z poczwarek.

Protokół

Ten protokół jest fragmentem z Kao et al., Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019).

1. Sekcja IFM po 48 godzinach APF

1. Zbierz niezbędny sprzęt, w tym dwa kleszczyki klasy biologicznej #5, drobne nożyczki, standardowe szklane szkiełka mikroskopowe, taśmę dwusztyftową, pipetę, końcówki do pipet, suchy lód i (w przypadku zastosowań RNA) odczynnik izolacyjny (patrz Tabela materiałów). Schłodzić 1x PBS i probówki mikrowirówkowe na lodzie.
2. Za pomocą lekko zwilżonego pędzla przenieś poczwarki na pasek dwustronnej taśmy klejącej zamontowany na szkiełku mikroskopowym (Rysunek 1A). Poczwarki należy umieścić w linii, zorientowanej w tej samej orientacji (brzusznie w dół i do przodu w kierunku dołu szkiełka).
   UWAGA: Uważaj, aby nie użyć zbyt dużo wody na pędzel lub filtr, w przeciwnym razie poczwarki nie będą się dobrze trzymać. Jeśli poczwarki się nie przyklejają, wysusz je, najpierw przenosząc do suchego filtra lub bibuły. Zamontuj tyle poczwarek, ile można wyciąć w ciągu 30 minut, najlepiej ~10 poczwarek.
3. Usuń poczwarkę z etui na poczwarkę. Użyj kleszczy, aby rozdzielić i otworzyć skrzynkę poczwarki powyżej przednich przetchlinków (Ryc. 1B).
4. Delikatnie przesuń parę kleszczyków grzbietowo w kierunku tylnym, przecinając obudowę poczwarki, gdy kleszcze się poruszają (Rysunek 1B'). Uważaj, aby nie rozerwać leżącej pod spodem poczwarki. Uwolnij poczwarkę z otwartego etui i natychmiast przenieś ją do kropli 1x PBS na drugim szkiełku mikroskopowym (Rysunek 1B",C).
5. Powtórz kroki 1.3 i 1.4 dla wszystkich poczwarek w linii, a następnie odłóż na bok suwak z taśmą dwusztyftową.
6. Za pomocą cienkich nożyczek odetnij odwłok poczwarki od klatki piersiowej i wepchnij go do osobnego stosu (Rysunek 1D,D'). Powtórz dla pozostałych poczwarek.
   UWAGA: Rozpocznij mierzenie czasu trwania sekcji od kroku 1.6, gdy tylko integralność poczwarki zostanie zakłócona. Wypreparuj jak najwięcej much w ciągu 20-30 minut, aby zapobiec śmierci komórki i związanym z nią zmianom transkryptomicznym i proteomicznym. Podczas preparacji 1 d dorosłych lub poczwarek >90 h, często wygodnie jest w późniejszych krokach dodatkowo usunąć głowę cienkimi nożyczkami.
7. Za pomocą bibuły usuń większość 1x PBS (zwykle mętny z zawieszonym tłuszczem), a także stos brzuchów (Rysunek 1E). Dodaj kroplę świeżego, schłodzonego 1x PBS do pozostałych torsów.
8. Użyj nożyczek, aby przeciąć klatkę piersiową na pół (Rysunek 1F,F'), przecinając od głowy w dół podłużną oś ciała jednym ruchem. Alternatywnie, jeśli głowa została usunięta, najpierw włóż nożyczki w miejscu, w którym głowa była przymocowana i przetnij górną połowę klatki piersiowej wzdłużnie między IFM. Następnie przetnij brzuszną stronę klatki piersiowej drugim cięciem w tej samej orientacji.
9. Powtórz kroki 1.7 i 1.8 dla wszystkich poczwarek, które mają zostać wycięte, generując stos hemisekcji klatki piersiowej w pobliżu środka szkiełka. Upewnij się, że na szkiełku jest wystarczająca ilość schłodzonego 1x PBS, aby hemisekcje nie wyschły.
   UWAGA: Po 48 godzinach APF IFM są na tyle duże, że są widoczne dla wprawnego oka pod standardowym mikroskopem preparacyjnym. Na tym etapie protokołu mięśnie z etykietą fluorescencyjną mogą zostać przeniesione do fluorescencyjnego zakresu preparacyjnego, aby pomóc w identyfikacji IFM lub w celach treningowych, ale nie jest to konieczne.
10. Wypreparuj IFM z klatki piersiowej. Odizoluj jedną z półsekcji za pomocą kleszczy #5 (Rysunek 1G,H). Delikatnie włóż końcówki jednego kleszcza powyżej i poniżej środka IFM (Rysunek 1G',H'). Trzymając pierwsze kleszcze nieruchomo, użyj cienkich nożyczek, aby odciąć jeden koniec IFM od naskórka i ścięgien. Następnie odetnij drugi koniec IFM od naskórka (Rysunek 1G'',H'').
    UWAGA: W zależności od orientacji klatki piersiowej po pierwszym cięciu IFM, przydatne jest obrócenie klatki piersiowej o 180°, aby drugie cięcie IFM było łatwiejsze do wykonania.
11. Usuń wiązkę IFM z klatki piersiowej za pomocą kleszczy (Rysunek 1G''',H'''), przenosząc ją na krawędź pęcherzyka PBS, aby użyć napięcia wody do utrzymania jej na miejscu (Rysunek 1I). Popchnij tuszę na przeciwną stronę zjeżdżalni. Powtórz te czynności dla pozostałych hemisekcji klatki piersiowej, generując kolekcję wypreparowanych IFMs.
    UWAGA: Jeśli IFM nie pozostają w schludnym stosie, usuń część 1x PBS za pomocą chusteczki. Uważaj, aby nie dopuścić do wyparowania wszystkich PBS i upewnij się, że wypreparowane IFM i hemithoraxs pozostają pokryte buforem.
12. Po przeprowadzeniu sekcji wszystkich IFM szybko przeprowadź kontrolę jakości wypreparowanego mięśnia. Za pomocą kleszczyków #5 usuń wszelkie fragmenty mięśni skokowych lub naskórka, które mogły znaleźć się w próbce (Rysunek 1J-K'').
    UWAGA: Mięsień skoku wygląda inaczej niż IFM. Jeśli rozwarstwia się mięsień znakowany Mef2-Gal4 pod wpływem fluorescencji, mięsień skokowy ma słabszą fluorescencję oraz inny kształt i teksturę. W normalnym świetle wydaje się prawie przezroczysty, podczas gdy IFM są nieprzezroczyste, mlecznożółte (Rysunek 1J-J'',K).
13. Używając naprężenia wody, uchwyć (ale nie zgniataj) rozcięte IFM między parą kleszczy (Rysunek 1L). Przenieś IFM do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml wstępnie napełnionej 250 μl schłodzonego 1x PBS (Rysunek 1M). Natychmiast przejść do sekcji 2.
    UWAGA: Kiedy końcówki kleszczy są zbliżane do siebie i wyjmowane z roztworu buforowego, napięcie wody powoduje wychwytywanie pęcherzyka buforu między końcówkami kleszczy. Jeśli IFM są również obecne w tym pęcherzyku, można je wyjąć z roztworu i łatwo przenieść do innego pojemnika wypełnionego buforem. Ważne jest, aby ścisnąć kleszcze, aby zbliżyć końcówki do siebie, nie dotykając się nawzajem, aby uniknąć maceracji tkanki uchwyconej w pęcherzyku buforowym.

2. Osadzanie i przechowywanie próbki IFM

1. Osadzaj IFM, odwirowując probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml przez 3–5 minut przy 2,000 x g w wirówce stołowej (Rysunek 2A,B).
2. Usuń bufor za pomocą końcówki pipety (Rysunek 2C).
3. W przypadku zastosowań RNA należy ponownie zawiesić osad IFM w 50–100 μl pożądanego bufora izolacyjnego RNA (patrz Tabela materiałów, Rysunek 2D). W przeciwnym razie przejdź do kroku 2.4.
   UWAGA: IFM można zamrozić na sucho po kroku 2.2 w celu przygotowania spektrometrii mas lub izolacji RNA za pomocą komercyjnych zestawów (patrz reprezentatywne wyniki). W przypadku zastosowań RNA lepsze wyniki uzyskuje się poprzez natychmiastowe ponowne zawieszenie i zamrożenie osadu IFM w buforze izolacyjnym
.
4. Zamrożenie próbki na suchym lodzie lub szybkie zamrożenie w ciekłym azocie (Rysunek 2E). Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie gotowe do kolejnych etapów przygotowania próbki do dalszej analizy.
   UWAGA: Po kriopkonserwacji próbki mogą być przechowywane przez kilka miesięcy przed przetworzeniem w celu dalszego badania.

Wyniki

Rysunek 1: Analiza IFM po 48 h APF. (A) Ustawianie poczwarek na podwójnej taśmie klejącej. (B) Usunięcie poczwarki z obudowy poczwarki poprzez otwarcie jej do przodu, przecięcie jej grzbietowo (B') i wyjęcie poczwarki (B''). Symbole kół są przedstawione tak samo jak na rysunku 2. (C) Przeniesienie poczwarek do bufora. (...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalki hodowlane 60 mm	Sigma-Aldrich	Z643084-600EA	Szalki Greiner, 60 mm x 15 mM, wentylowane
Aparat w telefonie komórkowym, Samsung Galaxy S9	Firma Samsung	SM-G960F/DS	Służy do zdjęć nie wykonanych pod mikroskopem
Podwójna taśma klejąca	Szkocka/3M	3M ID 70005108587	Taśma dwustronna, dostępna w większości punktów obsługi artykułów biurowych
Dumont #5 Kleszcze	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11252-20	Kleszczyki Inox proste końcówki 11 cm, klasa biologiczna z końcówką 0,05 mm x 0,02 mm
fluorescencyjny mikroskop preparacyjny, aparat Leica DFC310 FX	Księga Leica		www.leica-microsystems.com
Oprogramowanie do mikroskopu fluorescencyjnego, Leica Application Suite (LAS) w wersji 4.0.0	Księga Leica		www.leica-microsystems.com
Fluorescencyjny mikroskop preparacyjny, Leica M165 FC	Księga Leica		www.leica-microsystems.com
Ulotka: Bru1[M2]			Mucha stockowa; W tym artykule
Ulotka: Bru1[M3]			Mucha stockowa; W tym artykule
Ulotka: Mef2-GAL4	Centrum Magazynowe w Bloomington	BDSC:27390	Kolba muchowa
Mucha: łosoś[1]	Centrum Magazynowe w Bloomington	3274	Kolba muchowa
Mucha: salm[FRT]			Stado muchowe; patrz Spletter i in., Elife, 2018
Latać: UAS-Bru1IR	Wiedeńskie Centrum Badawcze Drosophila	GD41568	Mucha na muchy, spinka do włosów RNAi
Latać: UAS-GFP::Gma	Centrum Magazynowe w Bloomington	BDSC:31776	Kolba muchowa
Ulotka: UAS-mCD8a::GFP	Centrum Magazynowe w Bloomington	BDSC:5130	Kolba muchowa
Latać: w[1118]	Centrum Magazynowe w Bloomington	Numer katalogowy: 3605	Kolba muchowa
Ulotka: weeP26			Stado muchowe; patrz Clyne et al., Genetics, 2003
Odczynnik do wykrywania GFP, GFP-Booster	ChromoTek	Zobacz materiał GBA488-100
glikogen	Invitrogen	Numer katalogowy 10814-010
Oprogramowanie do przetwarzania obrazów, Photoshop CS6	Adobe		www.adobe.com
Izopropanol	Sigma-Aldrich	I9516-25ML	2-propanol
Metoda 1 (izolacja RNA): TRIzol	Technologie życiowe	15596018	Izotiocyjanian guanidyny i jednofazowy roztwór fenolu
Metoda 2 (izolacja RNA): Metoda 1 + zestaw TURBO bez DNA	Invitrogen	AM1907	Izolacja TRIzolu, a następnie leczenie zestawem do usuwania DNA
Metoda 3 (izolacja RNA): Zestaw Miniprep Plus Direct-zol RNA	Badania Zymo	Przekaźnik R2070S	Izolacja RNA w TRIzolu, ale nad komercyjnymi kolumnami zamiast przy użyciu separacji faz. Zalecane leczenie DNazą wykonane z użyciem Monarch Dnazy I w buforze reakcyjnym Monarch DNazy I.
Metoda 4 (izolacja RNA): zestaw RNeasy Plus Mini	Qiagen powiedział:	Numer katalogowy: 74134	Zastosowaliśmy dostarczoną kurację DNazą. Granulki IFM homogenizowano w buforze RTL, zgodnie z sugestiami dla tkanek zwierzęcych.
Metoda 5 (izolacja RNA): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System	Preparat Promega	Zobacz materiał Z6110	Zastosowaliśmy protokół "Oczyszczania RNA z tkanek włóknistych".
Metoda 6 (izolacja RNA): Zestaw Monarch Total RNA Miniprep	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	T2010G	Zastosowaliśmy protokół dla tkanek/leukocytów i poddaliśmy go lizie w 300 μL odczynnika do ochrony RNA.
Probówki do mikrowirówek	Rybak termiczny	AM12400	Probówki do mikrofuge bez RNaz, 1,5 ml
Szkiełka mikroskopowe	Rybak termiczny	12342108	Prowadnice standardowe, nieładowane, 1 mm
pędzel	Marabu powiedział:	1910000000	Marabu Fino Round No. 0 lub podobny pędzel z dowolnego zaopatrzenia artystycznego
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127
Bufor PBS (1x)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P4417	Tabletki z solą fizjologiczną buforowaną fosforanowymi na 1 l roztworów, pH 7,4
Końcówki do pipet PFA PureTip	Elementarny Naukowy	ES-7000-0101	Opcjonalny zamiennik standardowych końcówek do pipet w celu zmniejszenia strat próbki; 100 ml, otwór 0,8 mm
Końcówki do pipet	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P5161	Uniwersalne końcówki do pipet 200 ml
Stężenie RNA Podejście 1 i ślady integralności RNA, Bioanalyzer	Technologie Agilent	G2939BA
Koncentracja RNA Podejście 2, Nanodrop	Rybak termiczny	Zobacz materiał ND-2000
Stężenie RNA Podejście 3, Fluorometr kubit 4	Invitrogen	Pytanie Q33238
RNaza A	Preparat Promega	A7937
Woda wolna od RNaz, pirowęglan dietylu (DEPC)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D5758	DEPC uzdatnia wodę przez noc, a następnie autoklaw, aby usunąć całą RNazę.
Zestaw RT #1: Zestaw odwrotnej transkryptazy Super Script III	Invitrogen	Numer katalogowy 18080-044	zestaw do odwrotnej transkrypcji
Zestaw RT #2: LunaScript	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	E3010S	zestaw do odwrotnej transkrypcji
Zestaw RT #3: Zestaw do odwrotnej transkrypcji QuantiNova	Qiagen powiedział:	Numer katalogowy: 205410	zestaw do odwrotnej transkrypcji
Oprogramowanie statystyczne: GraphPad Prism	Pryzmat GraphPad		www.graphpad.com
Oprogramowanie statystyczne: Microscoft Excel	Firmy Microsoft		Zakupione w ramach pakietu: Office 2019 dla Użytkowników Domowych i Uczniów
Wirówka stołowa	Eppendorf	5405000760	Eppendorf Centrifuge 5425 lub równoważny
Chusteczki higieniczne/ chusteczki higieniczne	Sigma-Aldrich	Z188956	Standardowe chusteczki chusteczki higieniczne
Pipeta transferowa	Sigma-Aldrich	Z350796	Pipeta plastikowa
Nożyczki sprężynowe Vannas	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 15000-00	Krawędź tnąca 3 mm, średnica końcówki 0,05 mm, długość 8 cm
Artykuł Whatman	Sigma-Aldrich	1004-070	Koła z bibuły filtracyjnej, klasa 4, 70 mm

SZT. TGL powiedział: Kit powiedział: powiedział: powiedział: