$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem Hancock et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2019).
1. Obrazowanie wapnia in vivo
- Użyć mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w laser na podczerwień i obiektyw zanurzeniowy w wodzie (patrz Tabela materiałów), zainstalowanego na stole z izolacją drgań. W celu wizualizacji wskaźników wapnia opartych na GFP należy dostroić laser do długości fali wzbudzenia 920 nm i zainstalować filtr pasmowo-przepustowy GFP.
- Za pomocą pokrętła regulacji zgrubnej Z przeskanuj oś Z mózgu i zlokalizuj interesujący Cię obszar mózgu. Użyj funkcji kadrowania, aby ustawić ostrość skanowania tylko na tym obszarze, aby zminimalizować czas skanowania, i obrócić widok skanowania tak, aby przednia część głowy była skierowana w dół.
- Dostosuj rozmiar klatki do 512 x 512 px, prędkość skanowania do > 4 Hz i obszar skanowania (w wymiarze Y) tak, aby interesujące Cię neurony były zakryte.
2. Wizualizacja wywołanych zapachem stanów przejściowych wapnia poprzez warunkowanie węchowe
- Użyj systemu dostarczania zapachów, który może dostarczyć kilka bodźców zapachowych w czasowo precyzyjny sposób.
- Użyj dodatkowego komputera do sterowania urządzeniem i do komunikacji z oprogramowaniem mikroskopu obrazowego, aby skoordynować stymulację zapachu z przechwytywaniem obrazu podczas eksperymentów.
- Zainicjuj wstępnie zaprogramowany pakiet makr zdolny do połączenia oprogramowania do akwizycji obrazu i programu dostarczania zapachu (np. pakiet makr VBA zainstalowany w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, patrz Tabela materiałów), który reaguje na zewnętrzny wyzwalacz wejściowy zapewniony przez zainicjowanie protokołu dostarczania zapachu w oddzielnym programie).
- Rozpocznij pomiar od monitorowania "przed treningiem"/naiwnych stanów przejściowych wapnia wywołanych zapachem w rozdzielczości 512 x 512 px i częstotliwości odświeżania 4 Hz. Dostarcz 2,5-sekundowy bodziec zapachowy otoczony dodatkową akwizycją obrazu przez 6,25 s poprzedzający początek zapachu (w celu ustalenia wartości bazowej F0) i 12,5 s po przesunięciu zapachu. Powtórz to z drugim środkiem zapachowym, a następnie z trzecim środkiem zapachowym.
- Kontynuuj 3 minuty po tym pomiarze z klasycznym kondycjonowaniem ("treningiem") muchy.
- Wybierz jeden z zapachów prezentowanych w fazie "przedtreningowej", aby stać się zapachem CS+, a drugi, aby stać się zapachem CS-. Prezentuj zapach CS+ za pomocą sterowanego komputerowo systemu dostarczania zapachów przez 60 sekund wraz z dwunastoma wstrząsami elektrycznymi 90 V.
- Po 60 s przerwie prezentuj sam zapach CS przez 60 s. Stosować jako substancje zapachowe 4-metylocykloheksanol i 3-oktanol. Nie należy podawać trzeciego środka zapachowego (np. 1-octen-3-ol) podczas tego treningu, ponieważ jest on stosowany tylko jako kontrola przed (krok 2.2.) i po (krok 2.4) fazie treningu.
- Ponownie zmierz stany przejściowe wapnia wywołane zapachem "po treningu", powtarzając protokół stymulacji zapachowej "przed treningiem" (krok 2.2.) 3 minuty po zakończeniu fazy treningu (krok 2.3).
UWAGA: Czas wykonania tego kroku powinien odzwierciedlać interesujący czas po utworzeniu pamięci (np. wykonaj ten krok 3-4 minuty po etapie kondycjonowania, aby zbadać pamięć krótkotrwałą). Zazwyczaj muchy mogą przetrwać kilka godzin w tym preparacie.
- Zapisz pliki obrazów w odpowiednim formacie (np. Tiff) do późniejszej analizy obrazu.