$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem Gervaise i Arur, Przestrzenna i czasowa analiza aktywnego ERK w linii zarodkowej C. elegans. J. Vis. Exp.(2016).
1. Sekcja dorosłych robaków w celu uzyskania gonad
- Pobrać 100 - 150 WT (N2) lub pożądany genotyp robaków w pożądanym i specyficznym stadium rozwoju (L1, L2, L3, L4, dorosłe itp.) w 100 μl buforu M9 w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
- Napełnij probówkę mikrowirówki 900 μl buforu M9 (patrz tabela materiałów). Odwirować probówki o stężeniu 1 000 x g w mikrowirówce przez 1 minutę w temperaturze otoczenia.
- Delikatnie usunąć 900 μl buforu M9 i wyrzucić. Usuń bufor pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że robaki nie zostaną przypadkowo usunięte.
- Powtórz kroki 1.2 - 1.3 jeszcze dwa razy, za każdym razem z nowym buforem M9. Gwarantuje to, że wszelkie bakterie, które zostały przeniesione wraz z robakami, zostaną skutecznie zmyte.
- Po końcowym płukaniu należy wyjąć z probówki 900 μl buforu M9 i wyrzucić.
- Pozostałe 100 μl buforu M9 zawierającego 100 - 150 robaków z końcówką do mikropipet o pojemności 200 μl przenieść do szklanego naczynia do zegarka z płaskim dnem. Przed użyciem należy upewnić się, że końcówka mikropipety została przecięta w miejscu oznaczonym 10 μl. Brak przecięcia końcówki spowoduje ścinanie robaków.
- Dodać 1 - 3 μl 0,1 M lewamizolu do szklanego naczynia zegarka zawierającego robaki w buforze M9. Delikatnie zakręć lewamizolem i M9, aby umożliwić równomierne mieszanie, aż robaki przestaną się poruszać.
UWAGA: Zapasy lewamizolu mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania. W tym przypadku należy zastosować wyższe stężenie 1 - 3 mM niż opisane w literaturze23 0,2 - 0,25 mM lewamizolu w celu uzyskania szybkiej utraty mobilności u zwierząt. Jeśli zwierzęta zbyt długo obdzierają się ze skóry w płynnej zawiesinie, wynikające z tego wzorce dpERK w gonadach mogą być zmienne (z powodu stresu lub braku odżywiania, lub obu). Bardziej powtarzalne wzory barwienia uzyskano przy użyciu 1 - 3 mM lewamizolu do sekcji.
- Podłącz dwie igły 25 G do dwóch strzykawek o pojemności 1 ml (rozmiar strzykawki nie ma znaczenia, grubość igły ma kluczowe znaczenie). Umieścić po jednej strzykawce w każdej ręce (Rysunek 1).
- Pod mikroskopem preparacyjnym umieść każdą igłę pod i nad każdym robakiem, jak pokazano na rysunku 1, i umieść drobne nacięcie na robaku w pobliżu drugiej opuszki gardłowej ruchem przypominającym nożyce. Po jednym nacięciu robaka przejdź do następnego zwierzęcia, aż wszystkie zwierzęta w naczyniu zostaną przynajmniej raz pokrojone.
UWAGA: Należy pamiętać, że kroki od 1.8 do 1.9 są zależne od czasu. Wytnij wszystkie robaki w naczyniu w czasie krótszym niż pięć minut, aby uzyskać powtarzalny wzór dpECK. Dłuższe czasy rozbioru spowodują wyłączenie sygnału dpERK, szczególnie w strefie 1. Dostosuj liczbę robaków na rundę sekcji (tj. 50 robaków vs. 150), jeśli to konieczne, aby pozostać w wyznaczonym przedziale czasowym.
- W przypadku, gdy wyciśnięta gonada nie jest widoczna podczas sekcji, nie próbuj kolejnego cięcia w tym samym zwierzęciu. Zwykle powoduje to tylko ścinanie zwierzęcia i nie powoduje wytłaczania gonady. Zamiast tego przejdź do następnego zwierzęcia. Robaki, w których gonady nie wytłaczają się, pojawią się jako takie na szkiełkach, które zostaną wykonane w sekcji 6 i mogą być ignorowane podczas obrazowania
UWAGA: Na wszystkich etapach sekcji i przetwarzania ważne jest, aby pamiętać, że gonada pozostanie przyczepiona do ciała/tuszy. Nie rozdzielaj gonady i ciała na siłę za pomocą igły. Często nieprawidłowe rozdarcie tkanki gonad w próbie odcięcia gonady od organizmu może skutkować fałszywym sygnałem przeciwciała. Ciało/tusza może być ignorowana podczas etapów obrazowania, a obrazowana jest tylko gonada. Dodatkowo, czasami komórki jelitowe mogą również służyć jako wewnętrzne kontrole/kontrole somatyczne dla testowanego przeciwciała.
Rycina 1: Demonstracja pozycji igieł podczas sekcji. Po lewej: Zdjęcie sekcji zwłok w trakcie. Po prawej: Pozycje igły w stosunku do robaka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
