PCR z pojedynczym robakiem: metoda ekstrakcji i amplifikacji genomowego DNA

Streszczenie

Źródło: Prior, H., et al. Szybki i łatwy potok do generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9.J. Vis. Exp.(2018).

Ten film opisuje technikę szybkiego badania pojedynczego nicienia pod kątem markera genetycznego za pomocą badania przesiewowego PCR. W przykładowym protokole przeprowadzamy badania przesiewowe pod kątem edycji genomu opartej na CRISPR.

Protokół

Poniższy protokół jest fragmentem Prior i in., Szybki i łatwy potok do generowania mutantów punktów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9, J. Vis. Exp. (2018).

PCR i genotypowanie pojedynczego robaka

1. Po 1 - 2 dniach składania jaj przenieś F₁s do pojedynczych nakrętek probówek paskowych do PCR zawierających 7 μl buforu do lizy robaków za pomocą kilofa do robaków (Tabela 1, Rysunek 1D, dzień 4 - 5).
2. Odwirować probówki do PCR z maksymalną prędkością przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby sprowadzić zwierzęta na dno probówki, i zamrozić probówki w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę
   UWAGA: Robaki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony.
3. Lizować zamrożone robaki w termocyklerze za pomocą następującego programu: 60 °C przez 60 min, 95 °C przez 15 min, 4 °C trzymać.
4. Ustawić PCR mastermix, jak pokazano w Tabeli 2.
5. Dodaj 21 μl mastermixu PCR do czystych probówek PCR, a następnie dodaj 4 μl lizy robaków z kroku 3. Dobrze wymieszać za pomocą pipety i uruchomić program PCR zgodnie z wytycznymi producenta (patrz Tabela materiałów).
6. Oczyść reakcje PCR za pomocą zestawu DNA Clean and Concentrate, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Eluować DNA, dodając 10 μl wody do kolumny wirowej.
7. Ustawić enzym restrykcyjny mastermix, jak pokazano w Tabeli 3.
8. Dodać 10 μl mastermixu enzymu restrykcyjnego do każdej oczyszczonej reakcji PCR i inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C.
9. Oddziel strawione produkty PCR na 1,5% żelu agarozowym przebiegaj pod napięciem 120 V przy użyciu 1x buforu Tris-acetate-EDTA (TAE).

Wyniki

Rysunek 1. Inżynieria CRISPR-Cas9 locus C. eleganssod-1. (A) Schematyczna ilustracja przedstawiająca strukturę ekson-intron locus sod-1 u C. elegans. Czerwony pasek oznacza położenie G93 w eksonie 3. Zestaw par starterów jest oznaczony czerwonymi strzałkami (F1-R1). (B) Wyrównanie sekwencji ludzkich i C. e...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Woda wolna od nukleaz	Synthego Inc.	dostarczane z zestawem sgRNA EZ kit
KCl	Sigma	Zobacz materiał P5405
Oczyszczanie i Koncentrator DNA	Badania Zymo	Zobacz materiał D4004
Zestaw do odzyskiwania DNA w żelu Zymoclean	Badania Zymo	Zobacz materiał D4002
Q5 Gorący start High-Fidelity 2X Master Mix	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał M0494L
Proteinaza K	Sigma	Zobacz materiał P2308
MgCl2	Sigma	Zobacz materiał M2393
NP-40	Sigma	Numer telefonu 74385
Tween-20	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP337-100
Roztwór do dekontaminacji RNaseZap	Fisher Naukowy	Zobacz materiał AM9780

powiedział: