$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem z Escorcia et al, Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).
1. Barwienie lipidów czerwienią nilową (NR)
- Przygotowanie roztworu podstawowego NR o stężeniu 5 mg/ml
- W butelce o pojemności 500 ml dodaj 100 mg proszku NR do 200 ml 100% acetonu.
- Przykryj butelkę folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło.
- Przed użyciem mieszać roztwór przez 2 godziny w ciemności.
- W przypadku długotrwałego stosowania roztwór podstawowy NR należy przechowywać w szczelnie zamkniętej butelce bez ekspozycji na światło. Skaluj roztwór podstawowy NR zgodnie z potrzebami badawczymi. Upewnij się, że ten sam roztwór podstawowy jest używany w eksperymentach z barwieniem NR, aby uzyskać spójne wyniki barwienia i obrazowania.
- Przygotowanie roztworu roboczego NR
- Na każdy 1 ml 40% izopropanolu (v/v) dodać 6 μl roztworu podstawowego NR.
- Przygotować 600 μl roztworu roboczego NR dla każdej próbki.
UWAGA: Przygotuj świeży roztwór roboczy NR tuż przed barwieniem. W zależności od potrzeb roztworu podstawowego NR należy użyć stożkowej probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml.
- Przygotowanie robaków do barwienia lipidami NR
- Wyhodować robaki do wczesnego stadium L4 w temperaturze 20 °C na pożywce wzrostowej nicieni (NGM) wysianej późną logarytmiczną OP50 E. coli.
- Zmyj robaki z płytki 1 ml 1x roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami + 0,01% roztworu Triton X-100 (PBST) i umieść zawiesinę robaków w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml.
- Odwirować robaki przy 560 x g przez 1 minutę. Usunąć supernatant i powtarzać ten krok, aż E. coli zostanie usunięta z zawiesiny.
- Dodać 100 μl 40% izopropanolu do osadu robaka i inkubować go w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
- Odwirować robaki przy 560 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant bez naruszania osadu robaka.
UWAGA: Użyj większych objętości PBST, aby zmyć robaki z płytek, jeśli używasz większych płytek lub plamisz więcej robaków na płytkę. Nie myj robaków w PBST dłużej niż 15 minut przed utrwaleniem próbki. Wykonaj dodatkowe płukania, jeśli supernatant nie jest oczyszczony z bakterii. Przeprowadzić inkubację w 40% izopropanolu za pomocą nutatora lub kołyski. Zawsze monitoruj probówki, aby upewnić się, że występuje pełne mieszanie próbki.
- Barwienie lipidów za pomocą NR
- W ciemności dodać 600 μl roztworu roboczego NR do każdej próbki. Odwróć probówki trzy razy i całkowicie wymieszaj robaki w roztworze NR.
- Obracać próbkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
- Po inkubacji odwirować robaki przy 560 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant.
- Dodać 600 μl PBST i inkubować próbki w ciemności przez 30 minut, aby usunąć nadmiar plamy NR.
- Odwirować próbki o masie 560 x g przez 1 minutę i usunąć całość z wyjątkiem około 50 μl supernatantu.
UWAGA: Inkubacja NR nie wymaga mieszania. Na tym etapie często osadzają się robaki.
- Przygotowanie preparatów do obrazowania mikroskopowego
- Zawiesić osad robaka w pozostałym supernatancie.
- Umieścić 5 μl zawiesiny robaków na szkiełku mikroskopowym i ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza.
- Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci przed obrazowaniem robaków.
- Przygotuj tylko kilka slajdów na raz. Zapewni to niezmienność obrazowania NR we wszystkich próbkach. Jakość obrazów wybarwionych NR pogarsza się po 6 godzinach. Dyskretne kropelki lipidów są trudne do zaobserwowania, a fluorescencja tła wzrasta, co zakłóca wykrywanie sygnału NR.
- Obrazowanie robaków barwionych NR
- Wyobraź sobie robaki w 5-krotnym powiększeniu, aby uchwycić kilka zwierząt w każdym polu widzenia.
- Przełącz się na 10-krotne powiększenie, aby lepiej określić ilościowo poszczególne robaki.
- Użyj kanału FITC/GFP do obrazowania robaków barwionych NR i wypróbuj różne czasy ekspozycji, aby określić optymalne warunki do oznaczania ilościowego.
- Zapisz pliki w formacie TIF, aby uniknąć utraty danych z powodu kompresji.
UWAGA: Typowe czasy naświetlania wahają się od 100-1000 ms. Mając optymalny czas naświetlania, należy go używać do wszystkich próbek, aby zachować spójność obrazowania.