$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem z Germany et al, Izolacja specyficznych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp.(2019).
1. Przygotowanie i zbieranie starych robaków do izolacji komórek
UWAGA: Poniżej wyjaśniono izolację neuronów cholinergicznych z transgenicznego unc-17::Szczep GFP (OH13083) uzyskany z repozytorium szczepu Caenorhabditis Genetics Center (CGC) na Uniwersytecie w Minnesocie. Konieczne jest utrzymanie sterylnych warunków, aby zapobiec zanieczyszczeniu grzybami lub bakteriami.
- Przygotuj i zsynchronizuj robaki metodą wybielania opisaną przez T. Stiernagle'a. W eksperymentach ze starzeniem robaki płytkowe umieszcza się na płytkach pożywki wzrostowej nicieni (NGM) zawierających 25 μM wodnego roztworu fluorodeoksyurydyny (FuDR) w celu zmniejszenia produkcji jaj i zatrzymania wylęgu jaj. Regularnie sprawdzaj płytki agarowe, aby zapobiec zanieczyszczeniu lub wykluwaniu się jaj, ponieważ spowoduje to niewiarygodne wyniki.
UWAGA: W przypadku komórek unc-17::GFP zazwyczaj stosuje się trzy płytki NGM o wymiarach 100 mm x 15 mm w celu wyizolowania wystarczającej liczby komórek będących przedmiotem zainteresowania.
- Zbierz robaki i przygotuj do izolacji komórek.
- Zbierz robaki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Robaki należy przepłukać z płytki 1,5 ml buforu M9 (1 mM MgSO4, 85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO, pH 7,0) i odwirować przez 5 minut przy 1 600 x g. Odrzucić supernatant i przemyć robaki 1 ml buforu M9. Powtórz wirowanie i umyj w sumie pięć razy, aby usunąć jak najwięcej zanieczyszczeń E. coli.
UWAGA: Dodanie antybiotyków (50 μg/ml), takich jak ampicylina, na tym etapie może pomóc w zmniejszeniu zanieczyszczenia bakteryjnego.
- Dla dwóch próbek należy przygotować 2 ml buforu do lizy dodecylosiarczanu sodu i ditiotreitolu (SDS-DTT): 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) i 3% (w/v) sacharozy.
- Przygotować 15 ml buforu izolacyjnego (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES [pH 7,3]) i przechowywać go na lodzie.
UWAGA: Zarówno bufor do lizy SDS-DTT, jak i bufor izolacyjny muszą być świeże przed każdym doświadczeniem.
- Przerwanie naskórka i izolacja pojedynczej komórki
- Odwirować zwierzęta zebrane w kroku 1.2.1 przez 5 minut przy 1 600 x g. Usunąć cały supernatant i zawiesić robaki w 1 ml pożywki M9 i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
- Robaki granulowane z odwirowaniem w ilości 1 600 x g przez 5 min.
- Dodać 200 μl buforu do lizy SDS-DTT do robaków i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Robaki powinny wydawać się "zmarszczone" wzdłuż ciała, jeśli są oglądane pod mikroskopem świetlnym.
UWAGA: Długotrwałe narażenie na bufor do lizy SDS-DTT może spowodować śmierć robaków, co można monitorować obserwując robaki. Robaki, które są martwe, wydłużają się i nie zwijają się.
- Dodać 800 μl lodowatego buforu izolacyjnego i wymieszać, delikatnie przesuwając probówkę.
- Robaki osadzać przez 1 minutę w temperaturze 13 000 x g w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i przemyć 1 ml buforu izolacyjnego.
- Powtórz krok 1.3.5 w sumie pięć razy, za każdym razem ostrożnie usuwając bufor izolacyjny.
- Dodać 100 μl mieszaniny proteazy ze Streptomyces griseus (15 mg/ml) (tabela materiałów) rozpuszczonej w buforze izolacyjnym do osadu i inkubować przez 10−15 min w temperaturze RT.
UWAGA: Podobnie jak w przypadku buforu do lizy SDS-DTT, przedłużone trawienie proteazy może powodować nadmierne rozszczepianie białek wzdłuż błony plazmatycznej, uniemożliwiając izolację GFP odsłoniętej powierzchniowo za pomocą kulek magnetycznych.
- Podczas inkubacji z mieszaniną proteazy należy zastosować mechaniczne zakłócenie, pipetując próbki w górę iw dół do dna probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówki mikropipety o pojemności 200 μl ~60−70 razy. Przyłóż końcówkę pipety do ścianki probówki mikrowirówki pod stałym ciśnieniem, aby prawidłowo oddzielić komórki.
- Aby określić etap trawienia, należy usunąć niewielką objętość (~1−5 μl) mieszaniny mineralizującej, upuścić ją na szkiełko podstawowe i sprawdzić za pomocą mikroskopu do hodowli tkankowych. Po 5-7 minutach inkubacji fragmenty robaka powinny mieć widocznie zredukowany naskórek, a zawiesina komórek będzie łatwo widoczna.
- Zatrzymaj reakcję z 900 μl dostępnej na rynku zimnej pożywki L-15 firmy Leibovitz uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i penicyliną-streptomycyną (końcowe stężenie przy 50 μg/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny).
- Izolowane fragmenty i komórki osadów należy odwirowywać przez 5 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Umyć granulowane komórki jeszcze dwukrotnie 1 ml zimnej pożywki z dodatkiem L-15, aby upewnić się, że nadmiar zanieczyszczeń i naskórka zostały usunięte.
- Zawiesić granulowane komórki w 1 ml pożywki z dodatkiem L-15 i pozostawić na lodzie na 30 minut. Weź górną warstwę, około 700−800 μl, do probówki mikrowirówkowej. Warstwa ta zawiera komórki bez szczątków komórkowych i zostanie wykorzystana w późniejszej izolacji komórek będących przedmiotem zainteresowania.
- Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, użyj automatycznego licznika komórek lub hemocytometru, aby zmierzyć gęstość komórek 10−25 μl izolowanych komórek.