$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem Clarke et al, Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).
Szczepy tetraploidalne mogą być weryfikowane poprzez liczenie chromosomów w ich niezapłodnionych oocytach. Mikroskopia fluorescencyjna może być stosowana do badań przesiewowych liczby par chromosomów w niezapłodnionych diploidalnych oocytach (przed podziałami mejotycznymi), jeśli szczep ma marker fluorescencyjny dla chromosomów. W przypadku braku fluorescencyjnych markerów chromosomowych nicienie tetraploidalne można badać przesiewowo, wiążąc nicienie i barwiąc barwnikiem DNA; patrz poniżej protokół utrwalania etanolu i barwienia całych zwierząt dichlorowodorkiem 4′,6-diamidyno-2′-fenyloindolu (DAPI).
Barwienie DAPI całego zwierzęcia
UWAGA: Tetraploidalne szczepy posiadające 12 połączonych par chromosomów mogą być weryfikowane przez DAPI barwiące te zwierzęta i liczące liczbę ciał DAPI w ich niezapłodnionych oocytach.
- Umieść 5 do 10 μl buforu M9 na szkiełku mikroskopowym, a następnie przenieś 6 - 10 nicieni do kropli.
- Pod mikroskopem preparacyjnym pobierz większość M9 z kropli bez usuwania nicieni za pomocą niestrzępiącej się chusteczki czyszczącej. Następnie natychmiast dodaj 10 μl kropli 90% etanolu na robaki. Pozwól robakom całkowicie wyschnąć, ale nie dłużej niż kilka sekund.
- Jak tylko etanol wyparuje (można to zobaczyć, jak to się dzieje pod mikroskopem preparacyjnym), dodaj dodatkowe 10 μl 90% etanolu na robaki.
- Powtórz krok 3.1.3 jeszcze trzy razy.
- Po odparowaniu ostatniej kropli etanolu dodać 6 μl barwnika DAPI lub Hoechst o zalecanym stężeniu końcowym w wybranym podłożu montażowym (na przykład rozcieńczenie 1:1 000 podstawowego stężenia DAPI 2 ng/μl w M9). Do długotrwałego przechowywania szkiełek można użyć 0,5% p-fenylenodiaminy rozpuszczonej w 20 mM Tris-HCl o pH 8,8, w 90% glicerolu jako roztwór zapobiegający blaknięciu, zamiast samego M9.
- Przykryj robaki na szkiełku szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Ocenić wynik w mikroskopie fluorescencyjnym (krok 3.1.7) co najmniej 10 minut po dodaniu szkiełka nakrywkowego. Preparaty bez antifade mogą być przechowywane przez kilka dni w temperaturze 4 °C przed nacięciem, ale jakość fluorescencji zaczyna spadać po kilku dniach.
- Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 100-krotnym powiększeniu oceń liczbę pojedynczych ciał DAPI (przypuszczalnie pojedynczych par chromosomów) w najbardziej dojrzałym niezapłodnionym oocycie, który bezpośrednio przylega do spermateki i nie dostał się jeszcze do spermateki ani macicy.
- Aby ocenić poszczególne ciała DAPI w jądrze oocytu, użyj precyzyjnej ostrości mikroskopu, aby powoli przesuwać się od góry jądra oocytu do dołu podczas liczenia. Następnie przelicz to samo jądro, przesuwając ognisko w przeciwnym kierunku (tj. od dołu do góry jądra), aby potwierdzić zliczoną liczbę ciał DAPI.
- Zdobądź najbardziej dojrzały niezapłodniony oocyt w każdej z dwóch gonad w co najmniej dziesięciu hermafrodytach na stabilny szczep Lon. Oocyty typu dzikiego mają średnio 6 ciał DAPI, 5 par autosomów i parę chromosomów płciowych. Obecność 12 ciał DAPI w oocycie stabilnych szczepów Lon wskazuje, że zwierzęta w tym szczepie są albo częściowymi (4 zestawy autosomów, 3 chromosomy X), albo pełnymi (4 zestawy autosomów, 4 chromosomy X) tetraploidami.
- Oblicz średnią liczbę ciał DAPI obserwowanych z wielu (co najmniej 10) oocytów na szczep. Niektóre pary chromosomów będą się stykać lub tuż nad sobą, więc liczba ciał DAPI w oocycie jest często mniejsza niż rzeczywista liczba par chromosomów.
- (Opcjonalnie) Dalsza walidacja stabilnych szczepów Lon, w których średnia liczba ciał DAPI wynosi 12, w celu przetestowania, czy są one pełnymi (4A, 4X) lub częściowymi (4A, 3X) tetraploidami poprzez barwienie immunofluorescencyjne na białkach osi chromosomów, takich jak HTP-3. To barwienie pozwoli rozróżnić pary chromosomów, pokazując wzór krzyżowy z pojedynczych niepołączonych chromosomów obecnych w częściowym tetraploidzie.