Karmienie RNAi w hodowli płynnej: wysokoprzepustowa metoda obniżania ekspresji genów u C. elegans

Streszczenie

Źródło: Groh, N. et al. Metody badania zmian w inherentnej agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp.(2017).

RNAi to potężne narzędzie genetyczne dostępne dla badaczy C. elegans. W tym filmie przedstawiono metodę leczenia większej liczby robaków RNAi niż karmienie płytkami przy użyciu płynnych warunków hodowli.

Protokół

Ten protokół jest fragmentem z Groh et al, Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Płynna hodowla zwierząt bez gonad w celu zebrania młodych i starszych zwierząt poddanych działaniu RNAi ukierunkowanego na interesujący gen

UWAGA: Reakcja niektórych genów na RNAi może być zależna od temperatury, jak opisano wcześniej. Jako alternatywę dla RNAi, zmutowany gen ....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolba hodowlana Fernbacha	Corning	4425-2XL	Pyrex, pojemność 2 800 ml, z 3 wgłębieniami na przegrody	tak
Zakrętka membranowa	Schott	1E+06	Zobacz materiał GL45	tak
Mieszalnik nutacyjny	Firma VWR	444-0148		tak
Lejek separacyjny	Nalgene powiedział:	4300-1000	Pojemność 1 000 ml	Nie
Strzykawka 1 ml	BD Plastipak	3E+05		Nie
Igła szara, 27 G x 1/2", 0,4 mm x 13 mm	Mikrolanca BD 3	3E+05		Nie
Filtry membranowe 0,025 μM	Milipory	VSWP04700		Nie
Pasek pH	Machery-Nagel	Numer katalogowy: 92110	Korekta pH 0-14	Nie
Koktajl inhibitorów proteazy	Roche	5E+09	Kompletne tabletki Mini wolne od EDTA	Nie
Okoksynol-9	Aplikacja	A1388	Tryton X-100	Nie
Kwas 4-morfolinetosiulfonowy (MES)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M1317		Nie
Glikol nonylofenylopolietylenowy	Aplikacja	A1694	Nonidet P40 (NP40)	Nie
DNaseI	Roche	5E+09	rekombinowany, wolny od RNaz	Nie
RNazaA	Preparat Promega	A7973	rozwiązanie	Nie
Barwienie blotem białkowym całkowitym	Rybak termiczny	S11791	Sypro Plama biała rubinowa	Nie
Barwienie w żelu białkowym ogółem	Rybak termiczny	S12001	Sypro Barwnik białkowy w żelu rubinowym	Nie
TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny)	Serva	Numer katalogowy: 36970		Nie
Jodoacetamid	Serva	Numer katalogowy: 26710		Nie
Wodorowęglan amonu	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy 9830		Nie
Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowania	Preparat Promega	V5111		Nie
Znaczniki izobaryczne do względnego i bezwzględnego oznaczania ilościowego	Sciex powiedział:	4E+06	Zestaw multipleksów odczynników iTRAQ	Nie
Wirówka Avanti J-26XP	Redlica Beckmann	4E+05		tak
Ultrawirówka Optima Max-XP	Redlica Beckmann	4E+05		Nie
Wirówka 5424R	Eppendorf	5E+09		tak
Wirówka 5702	Eppendorf	6E+09		tak
Wirówka Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07		Nie
Koncentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Parownik odśrodkowy	Nie
Stereoskop fluorescencyjny M165 FC	Księga Leica		Z obiektywem Planapo 2.0x	Nie
Mikroskop preparacyjny	Księga Leica		Leica S6E	tak
Mikroskop o dużym powiększeniu Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		Z obiektywem PlanAPOCHROMAT 20x i kamerą Zeiss Axio Cam MRm	Nie
oprogramowanie				Nie
Oprogramowanie do analizy obrazu	ObrazJ			Nie
Analiza danych ze spektrometrii mas	Poszukiwacz białek		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	Nie
Szczepy E.coli
Zobacz materiał OP50	CGC (Międzynarodowa Organizacja T
Bakterie RNAi
L4440	Biblioteka RNAi Julie Ahringer
Mutanty C. elegans
Zobacz materiał CF2253	CGC, nazwa szczepu: EJ1158		Genotyp: gon-2(q388)
Transgeniczne C. elegans
Dysk DCD214	Laboratorium Della Davida w DZNE Tübingen		Genotyp: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
Kontroler DCD215	Laboratorium Della Davida w DZNE Tübingen		Genotyp: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]

szt. (wersja angielska) (wersja angielska) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: