Karmienie RNAi w hodowli płynnej: wysokoprzepustowa metoda obniżania ekspresji genów u C. elegans

Streszczenie

Źródło: Groh, N. et al. Metody badania zmian w inherentnej agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp.(2017).

RNAi to potężne narzędzie genetyczne dostępne dla badaczy C. elegans. W tym filmie przedstawiono metodę leczenia większej liczby robaków RNAi niż karmienie płytkami przy użyciu płynnych warunków hodowli.

Protokół

Ten protokół jest fragmentem z Groh et al, Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Płynna hodowla zwierząt bez gonad w celu zebrania młodych i starszych zwierząt poddanych działaniu RNAi ukierunkowanego na interesujący gen

UWAGA: Reakcja niektórych genów na RNAi może być zależna od temperatury, jak opisano wcześniej. Jako alternatywę dla RNAi, zmutowany gen może zostać włączony do tła gon-2(-).

1. Przygotowanie bakterii do hodowli płynnej
   1. Przygotować bakterie OP50 i RNAi (bakterie wytwarzające pożądane dsRNA i bakterie z pustym wektorem jako kontrolą) poprzez zaszczepienie 4 l pożywki LB 12 ml odpowiedniej kultury bakteryjnej (dodać końcowe stężenie 50 μg/ml karbenicyliny i 1 mM IPTG do kultur bakteryjnych RNAi) i inkubować je w temperaturze 37 °C przez noc przy 180 obr./min.
   2. Następnego dnia zebrać kultury w temperaturze 6 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatanty i ponownie zawiesić każdą osadkę w 60 ml lodowatego podłoża podstawowego S (100 mM NaCl, 50 mM fosforanu potasu pH 6, przechowywanego na lodzie). Przechowywać trzy zawieszone osadki (OP50, bakterie kontrolne RNAi i bakterie RNAi dla genu będącego przedmiotem zainteresowania) w temperaturze 4 °C do kroku 1.2.
      UWAGA: Robaki mogą być hodowane na RNAi od stadium L1 lub w celu uniknięcia wad rozwojowych od ostatniego stadium larwalnego L4 (patrz krok 1.2).
2. Płynna hodowla do leczenia RNAi, począwszy od ostatniego stadium larwalnego L4
   1. Dodać 200 ml pożywki podstawowej S do kolby hodowlanej Fernbacha (pojemność 2 800 ml). Aby uzyskać końcową objętość hodowli wynoszącą 300 ml (patrz 1.2.2.4), dodać 10 mM cytrynianu potasu o pH 6, 3 ml roztworu metali śladowych (5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 2,5 mM_FeSO4, 1 mM MnCl₂, 1 mM ZnSO₄, 0,1 mM CuSO₄), 3 mM MgSO₄, 3 mM CaCl₂, 100 ng/ml karbendazymu i 5 μg/ml cholesterolu). Zamknąć kolbę zakrętką membranową. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z przepisami dotyczącymi.
   2. Wyjąć L1 z 25 °C i przenieść je do probówek o pojemności 15 ml. Wirować przy 1 900 x g przez 3 minuty, usunąć supernatant i policzyć L1 na 2 μL. Dodać 500 000 L1 do kolby hodowlanej Fernbacha przygotowanej w poprzednim kroku.
   3. Dodaj OP50 (z kroku 1.1) proporcjonalnie do liczby robaków. Na przykład na 500 000 robaków dodaj 60 ml OP50.
   4. Kompletna hodowla robaków z S base, aby zwiększyć całkowitą objętość do 300 ml. Inkubować kulturę robaków do stadium L4 w temperaturze 25 °C w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 150 obr./min.
   5. Następnego dnia robaki powinny być wielkości L4 typu dzikiego. Aby zmienić bakterie z OP50 na RNAi, zbierz zwierzęta do sześciu probówek o pojemności 50 ml, pozwól im się osadzać i usuń supernatant. Przemyć L4s M9 w celu usunięcia resztek bakterii OP50: odwirować przy 1900 x g przez 3 minuty, usunąć supernatant i przenieść wszystkie L4 do jednej probówki o pojemności 50 ml. Policz L4 na 5 μl (co najmniej dziewięć razy). Dwa razy 50 000 L4 jest potrzebne do zebrania młodych robaków i dwa razy 100 000 L4 są potrzebne do zebrania starych robaków.
   6. Przygotować cztery kolby hodowlane Fernbacha zgodnie z opisem w ppkt 1.2.2.1. Dodać również końcowe stężenie 50 μg/ml karbenicyliny i 1 mM IPTG do każdej kolby.
   7. Dodać kontrolne bakterie RNAi i bakterie RNAi dla genu będącego przedmiotem zainteresowania (od kroku 1.1) proporcjonalnie do liczby robaków: Dodać 7 ml odpowiednich bakterii na kolbę w przypadku młodych robaków i 14 ml na kolbę w wieku dojrzałym robaków.
   8. Dodaj 50 000 robaków na kolbę dla kolekcji młodych robaków i 100 000 robaków na kolbę dla kolekcji starych robaków i uzupełnij kultury z bazą S, aby wypełnić do 300 ml. Inkubować kultury robaków (w sumie cztery) w temperaturze 25 °C i 150 obr./min.

2. Utrzymanie płynnych kultur C. elegans

1. Okresowo pobierać podwielokrotność z każdej płynnej kultury i umieszczać na szkiełku podstawowym (alternatywnie na płytce agarowej) w celu sprawdzenia, czy nie ma zanieczyszczeń. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego sprawdź poziom pokarmu bakteryjnego w kulturze, zwłaszcza w fazie wzrostu. Przygotować z wyprzedzeniem 2 l kultur kontrolnych bakterii RNAi i bakterii RNAi dla interesującego genu, jak opisano w kroku 1.1. W razie potrzeby dodać je do płynnych kultur C. elegans, a resztę przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Okresowo sprawdzaj, czy zwierzęta są bezpłodne. Większość zwierząt nie będzie miała gonady. W zależności od penetracji mutacji gon-2, niektóre mogą mieć poronione struktury gonadalne, ale nie należy obserwować zwierząt z jajami.

Roztwór podstawowy	kwota	Końcowe stężenie	Komentarze/Opis
S podstawowy (dla 500 ml: 5,9 g NaCl, 50 ml 1 M fosforanu potasu pH 6)	200 ml		1 M Fosforan potasu pH 6: Dla 1 l: 129 g KH2PO4 monobasic, 52 g K2HPO4 dwuzasadowy bezwodny
1 M Cytrynian potasu pH 6 (Na 400 ml: 13,1 g monohydratu kwasu cytrynowego, 134,4 g cytrynianu tripotasu jednowodnego)	3 ml	10 mM
Roztwór metali śladowych (Dla 1 l: 1,86 g kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g MnCl2 · 4 H2O, 0,29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 g CuSO4 · 5 H2O)	3 ml		Przechowywać roztwór podstawowy w ciemności w temperaturze 4 °C
1 M MgSO4 (dla 500 ml: 123,3 g)	900 μL	3 mM
1 M CaCl2 (dla 500 ml: 73,5 g)	900 μL	3 mM
200 μg/ml karbendazymu (Dla 50 ml: 10 mg w metanolu)	150 μL	100 ng/ml
5 mg/ml Cholesterol (Na 100 ml: 0,5 g w etanolu)	300 μL	5 μg/ml

Tabela 1.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolba hodowlana Fernbacha	Corning	4425-2XL	Pyrex, pojemność 2 800 ml, z 3 wgłębieniami na przegrody	tak
Zakrętka membranowa	Schott	1E+06	Zobacz materiał GL45	tak
Mieszalnik nutacyjny	Firma VWR	444-0148		tak
Lejek separacyjny	Nalgene powiedział:	4300-1000	Pojemność 1 000 ml	Nie
Strzykawka 1 ml	BD Plastipak	3E+05		Nie
Igła szara, 27 G x 1/2", 0,4 mm x 13 mm	Mikrolanca BD 3	3E+05		Nie
Filtry membranowe 0,025 μM	Milipory	VSWP04700		Nie
Pasek pH	Machery-Nagel	Numer katalogowy: 92110	Korekta pH 0-14	Nie
Koktajl inhibitorów proteazy	Roche	5E+09	Kompletne tabletki Mini wolne od EDTA	Nie
Okoksynol-9	Aplikacja	A1388	Tryton X-100	Nie
Kwas 4-morfolinetosiulfonowy (MES)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M1317		Nie
Glikol nonylofenylopolietylenowy	Aplikacja	A1694	Nonidet P40 (NP40)	Nie
DNaseI	Roche	5E+09	rekombinowany, wolny od RNaz	Nie
RNazaA	Preparat Promega	A7973	rozwiązanie	Nie
Barwienie blotem białkowym całkowitym	Rybak termiczny	S11791	Sypro Plama biała rubinowa	Nie
Barwienie w żelu białkowym ogółem	Rybak termiczny	S12001	Sypro Barwnik białkowy w żelu rubinowym	Nie
TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny)	Serva	Numer katalogowy: 36970		Nie
Jodoacetamid	Serva	Numer katalogowy: 26710		Nie
Wodorowęglan amonu	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy 9830		Nie
Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowania	Preparat Promega	V5111		Nie
Znaczniki izobaryczne do względnego i bezwzględnego oznaczania ilościowego	Sciex powiedział:	4E+06	Zestaw multipleksów odczynników iTRAQ	Nie
Wirówka Avanti J-26XP	Redlica Beckmann	4E+05		tak
Ultrawirówka Optima Max-XP	Redlica Beckmann	4E+05		Nie
Wirówka 5424R	Eppendorf	5E+09		tak
Wirówka 5702	Eppendorf	6E+09		tak
Wirówka Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07		Nie
Koncentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Parownik odśrodkowy	Nie
Stereoskop fluorescencyjny M165 FC	Księga Leica		Z obiektywem Planapo 2.0x	Nie
Mikroskop preparacyjny	Księga Leica		Leica S6E	tak
Mikroskop o dużym powiększeniu Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		Z obiektywem PlanAPOCHROMAT 20x i kamerą Zeiss Axio Cam MRm	Nie
oprogramowanie				Nie
Oprogramowanie do analizy obrazu	ObrazJ			Nie
Analiza danych ze spektrometrii mas	Poszukiwacz białek		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	Nie
Szczepy E.coli
Zobacz materiał OP50	CGC (Międzynarodowa Organizacja T
Bakterie RNAi
L4440	Biblioteka RNAi Julie Ahringer
Mutanty C. elegans
Zobacz materiał CF2253	CGC, nazwa szczepu: EJ1158		Genotyp: gon-2(q388)
Transgeniczne C. elegans
Dysk DCD214	Laboratorium Della Davida w DZNE Tübingen		Genotyp: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
Kontroler DCD215	Laboratorium Della Davida w DZNE Tübingen		Genotyp: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]

szt. (wersja angielska) (wersja angielska) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: