Artykuł metodologiczny

Karmienie RNAi w hodowli płynnej: wysokoprzepustowa metoda obniżania ekspresji genów u C. elegans

2.6K wyświetleń

30 kwietnia 2023

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Groh, N. et al. Metody badania zmian w inherentnej agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp.(2017).

RNAi to potężne narzędzie genetyczne dostępne dla badaczy C. elegans. W tym filmie przedstawiono metodę leczenia większej liczby robaków RNAi niż karmienie płytkami przy użyciu płynnych warunków hodowli.

Protokół

Ten protokół jest fragmentem z Groh et al, Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Płynna hodowla zwierząt bez gonad w celu zebrania młodych i starszych zwierząt poddanych działaniu RNAi ukierunkowanego na interesujący gen

UWAGA: Reakcja niektórych genów na RNAi może być zależna od temperatury, jak opisano wcześniej. Jako alternatywę dla RNAi, zmutowany gen może zostać włączony do tła gon-2(-).

  1. Przygotowanie bakterii do hodowli płynnej
    1. Przygotować bakterie OP50 i RNAi (bakterie wytwarzające pożądane dsRNA i bakterie z pustym wektorem jako kontrolą) poprzez zaszczepienie 4 l pożywki LB 12 ml odpowiedniej kultury bakteryjnej (dodać końcowe stężenie 50 μg/ml karbenicyliny i 1 mM IPTG do kultur bakteryjnych RNAi) i inkubować je w temperaturze 37 °C przez noc przy 180 obr./min.
    2. Następnego dnia zebrać kultury w temperaturze 6 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatanty i ponownie zawiesić każdą osadkę w 60 ml lodowatego podłoża podstawowego S (100 mM NaCl, 50 mM fosforanu potasu pH 6, przechowywanego na lodzie). Przechowywać trzy zawieszone osadki (OP50, bakterie kontrolne RNAi i bakterie RNAi dla genu będącego przedmiotem zainteresowania) w temperaturze 4 °C do kroku 1.2.
      UWAGA: Robaki mogą być hodowane na RNAi od stadium L1 lub w celu uniknięcia wad rozwojowych od ostatniego stadium larwalnego L4 (patrz krok 1.2).
  2. Płynna hodowla do leczenia RNAi, począwszy od ostatniego stadium larwalnego L4
    1. Dodać 200 ml pożywki podstawowej S do kolby hodowlanej Fernbacha (pojemność 2 800 ml). Aby uzyskać końcową objętość hodowli wynoszącą 300 ml (patrz 1.2.2.4), dodać 10 mM cytrynianu potasu o pH 6, 3 ml roztworu metali śladowych (5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 2,5 mMFeSO4, 1 mM MnCl2, 1 mM ZnSO4, 0,1 mM CuSO4), 3 mM MgSO4, 3 mM CaCl2, 100 ng/ml karbendazymu i 5 μg/ml cholesterolu). Zamknąć kolbę zakrętką membranową. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z przepisami dotyczącymi.
    2. Wyjąć L1 z 25 °C i przenieść je do probówek o pojemności 15 ml. Wirować przy 1 900 x g przez 3 minuty, usunąć supernatant i policzyć L1 na 2 μL. Dodać 500 000 L1 do kolby hodowlanej Fernbacha przygotowanej w poprzednim kroku.
    3. Dodaj OP50 (z kroku 1.1) proporcjonalnie do liczby robaków. Na przykład na 500 000 robaków dodaj 60 ml OP50.
    4. Kompletna hodowla robaków z S base, aby zwiększyć całkowitą objętość do 300 ml. Inkubować kulturę robaków do stadium L4 w temperaturze 25 °C w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 150 obr./min.
    5. Następnego dnia robaki powinny być wielkości L4 typu dzikiego. Aby zmienić bakterie z OP50 na RNAi, zbierz zwierzęta do sześciu probówek o pojemności 50 ml, pozwól im się osadzać i usuń supernatant. Przemyć L4s M9 w celu usunięcia resztek bakterii OP50: odwirować przy 1900 x g przez 3 minuty, usunąć supernatant i przenieść wszystkie L4 do jednej probówki o pojemności 50 ml. Policz L4 na 5 μl (co najmniej dziewięć razy). Dwa razy 50 000 L4 jest potrzebne do zebrania młodych robaków i dwa razy 100 000 L4 są potrzebne do zebrania starych robaków.
    6. Przygotować cztery kolby hodowlane Fernbacha zgodnie z opisem w ppkt 1.2.2.1. Dodać również końcowe stężenie 50 μg/ml karbenicyliny i 1 mM IPTG do każdej kolby.
    7. Dodać kontrolne bakterie RNAi i bakterie RNAi dla genu będącego przedmiotem zainteresowania (od kroku 1.1) proporcjonalnie do liczby robaków: Dodać 7 ml odpowiednich bakterii na kolbę w przypadku młodych robaków i 14 ml na kolbę w wieku dojrzałym robaków.
    8. Dodaj 50 000 robaków na kolbę dla kolekcji młodych robaków i 100 000 robaków na kolbę dla kolekcji starych robaków i uzupełnij kultury z bazą S, aby wypełnić do 300 ml. Inkubować kultury robaków (w sumie cztery) w temperaturze 25 °C i 150 obr./min.

2. Utrzymanie płynnych kultur C. elegans

  1. Okresowo pobierać podwielokrotność z każdej płynnej kultury i umieszczać na szkiełku podstawowym (alternatywnie na płytce agarowej) w celu sprawdzenia, czy nie ma zanieczyszczeń. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego sprawdź poziom pokarmu bakteryjnego w kulturze, zwłaszcza w fazie wzrostu. Przygotować z wyprzedzeniem 2 l kultur kontrolnych bakterii RNAi i bakterii RNAi dla interesującego genu, jak opisano w kroku 1.1. W razie potrzeby dodać je do płynnych kultur C. elegans, a resztę przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Okresowo sprawdzaj, czy zwierzęta są bezpłodne. Większość zwierząt nie będzie miała gonady. W zależności od penetracji mutacji gon-2, niektóre mogą mieć poronione struktury gonadalne, ale nie należy obserwować zwierząt z jajami.
Roztwór podstawowykwotaKońcowe stężenieKomentarze/Opis
S podstawowy (dla 500 ml: 5,9 g NaCl,
50 ml 1 M fosforanu potasu pH 6)
200 ml1 M Fosforan potasu pH 6: Dla 1 l: 129 g KH2PO4 monobasic,
52 g K2HPO4 dwuzasadowy bezwodny
1 M Cytrynian potasu pH 6
(Na 400 ml: 13,1 g monohydratu kwasu cytrynowego,
134,4 g cytrynianu tripotasu jednowodnego)
3 ml10 mM
Roztwór metali śladowych
(Dla 1 l: 1,86 g kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA),
0,69 g FeSO4 · 7 H2O,
0,2 g MnCl2 · 4 H2O,
0,29 g ZnSO4 · 7 H2O,
0,025 g CuSO4 · 5 H2O)
3 mlPrzechowywać roztwór podstawowy w ciemności w temperaturze 4 °C
1 M MgSO4 (dla 500 ml: 123,3 g)900 μL3 mM
1 M CaCl2 (dla 500 ml: 73,5 g)900 μL3 mM
200 μg/ml karbendazymu
(Dla 50 ml: 10 mg w metanolu)
150 μL100 ng/ml
5 mg/ml Cholesterol
(Na 100 ml: 0,5 g w etanolu)
300 μL5 μg/ml

Tabela 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolba hodowlana Fernbacha Corning4425-2XLPyrex, pojemność 2 800 ml, z 3 wgłębieniami na przegrodytak
Zakrętka membranowa Schott1E+06Zobacz materiał GL45tak
Mieszalnik nutacyjnyFirma VWR444-0148tak
Lejek separacyjnyNalgene powiedział:4300-1000Pojemność 1 000 mlNie
Strzykawka 1 ml BD Plastipak3E+05Nie
Igła szara, 27 G x 1/2", 0,4 mm x 13 mmMikrolanca BD 33E+05Nie
Filtry membranowe 0,025 μMMiliporyVSWP04700Nie
Pasek pHMachery-NagelNumer katalogowy: 92110Korekta pH 0-14Nie
Koktajl inhibitorów proteazyRoche5E+09Kompletne tabletki Mini wolne od EDTA Nie
Okoksynol-9 AplikacjaA1388Tryton X-100Nie
Kwas 4-morfolinetosiulfonowy (MES)Sigma-AldrichZobacz materiał M1317Nie
Glikol nonylofenylopolietylenowyAplikacjaA1694Nonidet P40 (NP40)Nie
DNaseIRoche5E+09rekombinowany, wolny od RNazNie
RNazaAPreparat PromegaA7973rozwiązanieNie
Barwienie blotem białkowym całkowitymRybak termicznyS11791Sypro Plama biała rubinowaNie
Barwienie w żelu białkowym ogółemRybak termicznyS12001Sypro Barwnik białkowy w żelu rubinowymNie
TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny)ServaNumer katalogowy: 36970Nie
JodoacetamidServaNumer katalogowy: 26710Nie
Wodorowęglan amonuSigma-AldrichNumer katalogowy 9830Nie
Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowaniaPreparat PromegaV5111Nie
Znaczniki izobaryczne do względnego i bezwzględnego oznaczania ilościowegoSciex powiedział:4E+06Zestaw multipleksów odczynników iTRAQNie
Wirówka Avanti J-26XPRedlica Beckmann4E+05tak
Ultrawirówka Optima Max-XPRedlica Beckmann4E+05Nie
Wirówka 5424REppendorf5E+09tak
Wirówka 5702Eppendorf6E+09tak
Wirówka Megafuge 40RThermo Scientific8E+07Nie
Koncentrator PlusEppendorf5E+09Parownik odśrodkowyNie
Stereoskop fluorescencyjny M165 FC Księga LeicaZ obiektywem Planapo 2.0xNie
Mikroskop preparacyjnyKsięga Leica Leica S6Etak
Mikroskop o dużym powiększeniu Zeiss Axio Observer Z1ZeissZ obiektywem PlanAPOCHROMAT 20x i kamerą Zeiss Axio Cam MRmNie
oprogramowanieNie
Oprogramowanie do analizy obrazuObrazJNie
Analiza danych ze spektrometrii masPoszukiwacz białekhttp://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htmNie
Szczepy E.coli
Zobacz materiał OP50CGC (Międzynarodowa Organizacja T
Bakterie RNAi
L4440Biblioteka RNAi Julie Ahringer
Mutanty C. elegans
Zobacz materiał CF2253CGC, nazwa szczepu: EJ1158 Genotyp: gon-2(q388)
Transgeniczne C. elegans
Dysk DCD214Laboratorium Della Davida w DZNE TübingenGenotyp: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
Kontroler DCD215Laboratorium Della Davida w DZNE TübingenGenotyp: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
szt. (wersja angielska) (wersja angielska) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wyciszanie gen whodowla nicienikarmienie bakteriamiprotok wirowaniaanaliza fenotypugen Daf 2inkubator z wytrz saniem

Powiązane artykuły