Jednoetapowa metabolomika: ilościowe oznaczanie węglowodanów, kwasów organicznych i aminokwasów w ramach jednej procedury

Podsumowanie

Twórca metody przedstawia sposób przygotowania próbek z wykorzystaniem ureazy do analizy GC/MS metabolitów pośrednich. Metoda ta umożliwia jednoczesne, jednowykrokową analizę uzupełniającą w ramach przesiewowych badań noworodków w kierunku wrodzonych błędów metabolizmu za pomocą tandemowej spektrometrii mas, poprzez ilościowe oznaczenie węglowodanów, kwasów organicznych i aminokwasów w jednym procesie.

Streszczenie

Każdy noworodek urodzony w USA jest obecnie badany w kierunku do 42 rzadkich zaburzeń genetycznych nazywanych „wrodzonymi błędami metabolizmu”. Metoda przesiewowa opiera się na tandemowej spektrometrii mas i służy do oznaczania ilości acylkarnityn w celu wykrycia organicznych acidemii, a także do pomiaru poziomu aminokwasów. We wszystkich stanach wykonuje się również testy enzymatyczne w kierunku zaburzeń metabolizmu węglowodanów, takich jak galaktozemia. Ze względu na to, że wyniki mogą być nieswoiste, w przypadku wyników dodatnich wymagane jest przeprowadzenie badań kontrolnych z wykorzystaniem bardziej rozstrzygającej metody. Niniejszy raport opisuje metodę przygotowania próbek z użyciem „ureazy” w badaniach przesiewowych w kierunku wrodzonych błędów metabolizmu. Krystaliczna ureaza jest stosowana do usuwania mocznika z płynów ustrojowych, co umożliwia odwodnienie i derywatyzację większości pozostałych rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w jednej procedurze w celu przeprowadzenia chromatografii gazowej. Odwodnienie poprzez odparowanie w strumieniu azotu jest ułatwione dzięki dodaniu acetonitrylu i chlorku metylenu. Następnie zachodzi trimetylosylilacja w obecności unikalnego katalizatora, trifluoroacetanu trietyloamoniowego. Po zautomatyzowanym wtryskiwaniu i chromatografii następuje sterowane makrami ilościowe oznaczenie 192 metabolitów oraz półilościowe oznaczenie każdego głównego składnika z wykorzystaniem specjalistycznych bibliotek widm masowych związków biologicznych derywatyzowanych przez TMS. Analizę można przeprowadzić na powszechnie stosowanej platformie Chemstation, korzystając z makr i bibliotek udostępnionych przez autora. W naszym laboratorium metodą tą przeanalizowano ponad 16 000 próbek pacjentów, uzyskując wydajność diagnostyczną na poziomie około 17% – oznacza to, że w 17% próbek uzyskano wyniki wymagające podjęcia działań przez lekarza kierującego. Obejmuje to ponad 180 potwierdzonych wrodzonych błędów metabolizmu, z których około 38% nie mogłoby zostać zdiagnozowanych przy użyciu poprzednich metod.

Protokół

Procedura przetwarzania próbek moczu

1. Rozmrozić próbkę moczu w kąpieli wodnej o temperaturze 37° C. Przelać do nowego pojemnika, jeśli oryginalny jest uszkodzony.
2. Pobrać maksymalną alikwot 13 ml próbki i przechowywać w temperaturze -20° C w oznakowanej stożkowej probówce wirówkowej.
3. Zmierzyć i zapisać gęstość optyczną próbki, umieszczając kilka kropli moczu w refraktometrze.
4. Przefiltrować próbkę przez filtr 0.2 um.
5. Odmierzyć objętość próbki zgodnie z poniższą gęstością optyczną:

   1.000-1.009	1.00 ml
   1.010-1.019	0.50 ml
   1.020-1.050	0.25 ml + 0.25 ml H2O

6. Określoną objętość przenosi się następnie do fiolki Reactivial zawierającej następujące standardy wewnętrzne: 500 nanomoli (nmoles) ₃ kreatyny; 10 nmoles d₃ kwasu metylomalonowego; po 100 nmoles każdego z następujących: ¹³C₃ mleczanu, ¹³C₃ pirogronianu, ¹³C₂ ¹⁵N glicyny, d₃ seryny, d₅ fenyloalaniny, d₁₁ heksanoiloglicyny, ¹⁵N₂ orotanu, d₄ kwasu sebacinowego, ¹³C₆ glukozy, d₆ inozytolu oraz d₅ tryptofanu.
7. Do próbki dodaje się 20 mikrolitrów (μl) roztworu ureazy o stężeniu 7.5 Units/μl (Calzyme Laboratories nr katalogowy 116A0100), a następnie próbkę przepłukuje i uszczelnia pod osłoną CO₂ za pomocą inertnego septa.
8. Próbkę utrzymuje się w temperaturze 37°C przez 30 minut, dodając więcej gazowego dwutlenku węgla w odstępach 15-minutowych w celu utrzymania ciśnienia.
9. Dodaje się kolejne 20 μl roztworu ureazy, fiolkę przepłukuje dwutlenkiem węgla i utrzymuje próbkę w temperaturze 37°C przez kolejne 15 minut.
10. Dodaje się 500 μl mieszaniny acetonu i metanolu w stosunku 30:70, gumowe septum zastępuje się septem powlekanym Teflonem, a próbkę chłodzi w temperaturze -20° C przez 15 minut.
11. Osad usuwa się poprzez wirowanie przy 1500 rpm przez 10 minut, a następnie ciecz przelewa się do czystej fiolki 2.0 cc Reactivial (Supelco/Sigma).
12. Dodać trifluoroacetan trietyloamoniu (TEA/TFA) (Sigma) w następujący sposób:
    • 20 μl dla próbek 1.00 ml
    • 40 μl dla próbek 0.5 ml lub mniejszych
13. Dopełnić acetonitrylem i pozostawić pod strumieniem azotu w temperaturze 70° C do momentu uzyskania stałej objętości (pozostanie TEA/TFA) (~ 15 minut).
14. Powtórzyć krok 13 do 4 razy, aż do utworzenia się osadu (~ 10 minut każdy).
15. Pozostawić do ostygnięcia przez około 2 minuty. Dopełnić chlorkiem metylenu, uważając, aby roztwór nie wykipiał, i osuszyć (~ 4:00 minuty).
16. Powtórzyć krok 15.
17. Dodać MSTFA (N-metylo-N-trimetylisilylotrifluoroacetamid) (Thermal Scientific) w następujących ilościach:
    • 150 μl dla próbek 1.00 ml
    • 200 μl dla próbek 0.50 ml lub mniejszych
18. Zamknąć pod atmosferą azotu i inkubować w temperaturze 70° C przez 1 godzinę.
19. Przenieść do mikrofiolek w atmosferze azotu w celu analizy na chromatografie gazowym / spektrometrze mas.
20. Umieścić mikrofiołki do automatycznego wstrzykiwania w urządzeniu Agilent 5975 GC/MS: Temperatury instrumentu wynoszą: injektor 200° C, interfejs 250° C, piec 80° C przez 1 minutę; gradient 4° C/minutę w zakresie 80-130° C, gradient 6° C/minutę w zakresie 130-200° C, gradient 12° C/minutę w zakresie 200-285° C, utrzymanie przez 10 minut. Kolumna: 25 m, średnica wewnętrzna 320 micron, grubość filmu 0.5 micron DB-5. Spektrometr mas: źródło 230° C, kwadrupol 150° C, skanowanie 50-650 amu przy 2.46 skanach/sek. Opóźnienie rozpuszczalnika 3.5 minuty.

Reprezentatywne wyniki

Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć reprezentatywne wyniki.

Dyskusja

Metoda ureazowa (1) została przytoczona 62 razy w literaturze medycznej z różnymi modyfikacjami. Grupa Matsumoto (2,3) uprościła procedurę w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowego screeningu noworodków i przedstawiła wyniki z 16000 pacjentów. Kuhara i inni (4-7) opisali zastosowanie tej metody w kilku przypadkach diagnostyki i monitorowania wrodzonych błędów metabolicznych. Rhead (8) potwierdził również użyteczność tej metody w diagnostyce klinicznej i monitorowaniu wrodzonych błędów metabolicznych. Metoda ta była stosowana do analizy moczu niedźwiedzi, myszy knock-out, słoni oraz homogenatów całych muszek owocowych i ich larw (9). Analizie poddano również pożywki z Cryptococcus przed i po mutogenezie celowanej, z pominięciem etapu ureazowego (10). Metodę zastosowano do oceny stanu odżywienia ludzi u studentów medycyny, pacjentów z zespołem Downa oraz otępiałych starszych weteranów po podaniu badanym doustnych dawek aminokwasów: tryptofanu, metioniny i izoleucyny (11). Wszystkie osiem witamin z grupy B oceniono poprzez ilościowe oznaczenie produktów rozkładu trzech aminokwasów, które w trakcie swojej degradacji wymagają wszystkich 8 witamin. Opisano toksyczne działanie farmaceutyków oraz jego łagodzenie poprzez suplementację witaminami (12). Przeanalizowano i opisano próbki płynu owodniowego z prawidłowych ciąż oraz ciąż z zespołem Downa (13-15).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MSD 5975	Agilent Technologies		GC/MS/Komputer
MSD 5973	Agilent Technologies		GC/MS/Komputer
Ureaza	Calzyme	116A0100	Również Sigma C3
Standardy stabilnych izotopów	CDN Isotopes
Rozpuszczalniki	Fisher Scientific
Anality	Sigma-Aldrich
Kolumny GC	J&W Scientific	123-5026
TEA/TFA	Fluka	09747
Fiolki	Supelco, Sigma-Aldrich	Z115088/12EA
Merlin Microseal	Agilent Technologies	5181-8815
MSTFA	Thermal Scientific, Inc.	48913