Drosophila Test labiryntu Y: metoda oceny reakcji węchowych u much

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Simonnet, M. M., et al. Testowanie węchu Drosophila za pomocą testu Y-labirynt. J. Vis. Exp. (2014).

Ten film opisuje metodę testowania węchowych zachowań eksploracyjnych u muszki owocowej, zwaną labiryntem Y. Prezentowany klip z protokołem pokazuje, jak skonfigurować i przeprowadzić test.

Protokół

Ten tekst protokołu jest fragmentem z Simonnet et al., Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay, J. Vis. Exp. (2014).

1. Przed rozpoczęciem

Użyj izogenicznego stado referencyjnego o stabilnych i solidnych fenotypach behawioralnych. Nie ma ogólnej zasady wyboru tego stada, ponieważ wszystkie potencjalne grupy kontrolne mogą zawierać heterogeniczne allele tła.
Użyj tego szczepu kontrolnego, aby skrzyżować wstecznie wszystkie inne stado niezbędne do późniejszych kroków. Ten etap krzyżowania wstecznego jest zwykle reprezentowany przez co najmniej 5 kolejnych krzyżówek pojedynczej dziewiczej samicy (aby umożliwić możliwe skrzyżowanie między chromosomami homologicznymi) do 2-3 izogenicznych samców referencyjnych. Ten krok jest ważny dla ujednolicenia tła genetycznego między różnymi stadami much.
Utrzymuj zapasy Drosophila na standardowej mące kukurydzianej (9%), drożdżach (10%) i podłożu agarowym (1,5%) uzupełnionym antybiotykiem (0,4% para-hydroksybenzoesanu metylu) w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w temperaturze 25 °C.
Przeprowadzanie eksperymentów chemosensorycznych w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (25 °C) w dalekim czerwonym świetle (w celu wyeliminowania wpływu sygnałów wizualnych i skupienia się na sygnałach chemosensorycznych). Regularnie wymieniaj powietrze w pomieszczeniu, aby przewietrzyć obszar między każdym eksperymentem.

2. Reakcja węchowa przy użyciu testu Y-labirynt

Przed badaniem należy zagłodzić muchy przez 16–18 godzin w temperaturze 25 °C w szklanych probówkach zawierających mokry ręcznik papierowy.
Połączyć łącznik w kształcie litery Y z dwiema szklanymi fiolkami i z mniejszą fiolką z tworzywa sztucznego (fiolką ładującą). Za pomocą końcówek do pipet o pojemności 1 ml przechodzących przez korki piankowe należy połączyć łącznik z trzema fiolkami i uzyskać szczelnie zamknięty labirynt Y. Odetnij wąskie końce dwóch końcówek pipet (o średnicy ~2 mm, aby uniknąć powrotu muchy po podjęciu decyzji), aby utworzyć dwie fiolki "pułapki" i duży koniec jednej końcówki pipety, aby utworzyć rurkę "ładującą" (Rysunek 1A).
Tuż przed podłączeniem fiolek z "pułapką" (Rysunek 1B), umieść jedną bibułę filtracyjną o średnicy ~6 mm w każdej fiolce. Dodać 40 μl roztworu nawaniacza na jedną bibułę filtracyjną i 40 μl odpowiedniego rozpuszczalnika na drugą bibułę filtracyjną.
Wprowadź dziesięć much w wieku od 4 do 9 dni do fiolki "ładującej". Nie należy stosować znieczulenia CO₂ podczas tego transferu, ponieważ ma to silny wpływ na zachowanie. Raczej użyj krótkiego chłodzenia na lodzie. Właściwa manipulacja znieczulonymi muchami jest ważna, aby w jak największym stopniu ograniczyć stres u badanych.
1. Wykonaj serię testów labiryntu Y w temperaturze 25 °C w dalekim świetle czerwonym (przy użyciu żarówek LED w celu ograniczenia możliwego źródła ciepła), aby w jak największym stopniu uniknąć bodźców wizualnych. Uważaj, aby zmienić orientację labiryntów Y (rurka zawierająca nazapach po lewej lub po prawej stronie i rurka ładująca z przodu lub z tyłu; Rysunek 1C).
2. Odczekać kilka godzin, aby muchy dostały się do fiolki pułapki zawierającej środek zapachowy lub rozpuszczalnik. Liczenie leci po 24 godzinach, aby zwiększyć udział do ponad 80% i zapewnić maksymalną wartość indeksu węchowego (Simonnet, komunikacja osobista).
3. Obliczyć wynikowy indeks węchowy, korzystając z następującego wzoru: (liczba w rurki zapachowej - liczba w probówce z rozpuszczalnikiem)/całkowita liczba załadowanych much.
Umyj zestaw Y-maze w następujący sposób: zdemontowany zestaw namocz w RBS 35 MD na noc. Dokładnie spłucz wodą z kranu. Na koniec spłucz wodą dejonizowaną i pozostaw do wyschnięcia.

3. Analiza statystyczna danych

Wykonaj test t, jednoczynnikową lub dwukierunkową wartość ANOVA, w zależności od danych i zmiennych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rycina 1: Męska reakcja węchowa oceniana za pomocą zestawu Y-labirynt. A) Podziel urządzenie. B) Zmontowane urządzenie. C) Ustawienie w stanie roboczym w dalekim czerwonym świetle. D) Kwantyfikacja męskich reakcji węchowych na kwas octowy (AA) lub kwas fenylooctowy (PAA) rozcieńczone w wodzie destylowanej (10% v/v) (N = 11, co daje w sumie 110 much). An...