Ten protokół jest fragmentem artykułu Brust-Mascher i Scholey, Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w syncytialnym zarodku Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2009).
Przepisy:
Talerze soku winogronowego:
- 5,5 g agaru bacto
- 14,5 g dekstrozy lub glukozy
- 7,15 g sacharozy
- 45 ml koncentratu soku winogronowego (sok 100%).
- 204,5 ml H20
- 625 μl 10N NaOH
Wymieszaj wszystkie składniki i mikrofalówkę aż do wrzenia.
Dodać 2,8 ml mieszanki kwasów (mieszanina kwasów: 20,9 ml kwasu propionowego, 2,1 ml kwasu fosforowego, 27 ml H20)
Wymieszaj i wylej na szalki Petriego o średnicy 35 mm. Pozostaw do zestalenia w temperaturze pokojowej na jeden lub dwa dni. Jeśli płytki nie będą używane w najbliższym czasie, należy je uszczelnić parafolią i przechowywać w temperaturze 4 °C (przed użyciem pozostawić do zrównoważenia do temperatury regulowanej).
Pasta drożdżowa:
Rozpuść około jednej łyżeczki drożdży (Sigma YSC2, drożdże z Saccharomyces cerevisiae typ II) w wodzie, aby uzyskać gęstą pastę. Umieść niewielką ilość tego na każdym talerzu z sokiem winogronowym tuż przed użyciem.
Bufor iniekcyjne:
- 150 mM K-asparaginian
- 10 mM K-fosforan
- 20 mM imidazolu, pH 7,2
Klej heptanowy:
Rozwiń podwójną taśmę klejącą i umieść w butelce o pojemności 100 ml, dodaj około 50 ml heptanu, zamknij butelkę i kołysz się przez kilka dni. Podczas używania dodaj heptan, jeśli klej jest zbyt gęsty.
Komora odwadniania:
Weź szalkę Petriego o średnicy 100 mm, włóż do niej jedną część szalki o średnicy 35 mm, aby zrobić "stół" i dodaj wokół niej Drierite (bezwodny siarczan wapnia) tak, aby wysokość Drierite nie była wyższa niż "stół" i przykryj. Szkiełko nakrywkowe z zarodkami zostanie umieszczone na tym "stole" w celu odwodnienia przed wstrzyknięciem. Dobrym pomysłem jest użycie przynajmniej części wskazującej Drierite i zmiana go, gdy zmieni kolor.
Protokół:
Protokół ten może być stosowany do wstrzykiwania praktycznie każdego rozpuszczalnego odczynnika do zarodka syncytialnego Drosophila: na przykład białka fluorescencyjnego do obserwacji lub inhibitora białka docelowego lub obu.
1. Pobieranie zarodków
- Połóż nowy talerz z sokiem winogronowym na klatce dla niosek.
- Usuń tę płytkę po godzinie, jest to pierwsza kolekcja w ciągu dnia i często nie jest zbyt dobra. Można go wyrzucić.
- Zmieniaj płytkę co godzinę, aby zbierać zarodki przez jedną godzinę każdy.
2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
- Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 50 x 22 mm po jednej stronie szkiełka mikroskopowego. Przyklej cztery rogi do zjeżdżalni, aby się nie poruszała.
- Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką nałóż jedną warstwę kleju heptanowego w jednej linii na szkiełko nakrywkowe (klej nie powinien być lepki i powinien wyschnąć w ciągu kilku sekund, w przeciwnym razie dodaj więcej heptanu).
- Umieść kawałek podwójnej taśmy klejącej na szkiełku w kierunku boku szkiełka nakrywkowego.
3. Przygotowanie zarodków
UWAGA: Zarodki powinny być zobrazowane około 2 godziny po rozpoczęciu pobierania, więc rozpocznij następujące kroki, dając wystarczająco dużo czasu na ich zakończenie w tym czasie.
- Za pomocą zwilżonej szczoteczki ostrożnie podnieś zarodki z talerza soku winogronowego i umieść na podwójnej taśmie klejącej na szkiełku.
- Za pomocą zewnętrznej części pęsety przetocz zarodki po podwójnej taśmie klejącej, aż kosmówka (błona zewnętrzna) pęknie.
- Podnieś zarodek, delikatnie przetaczając go po kosmówce, tak aby przykleił się do pęsety i umieść go na kleju heptanowym na szkiełku nakrywkowym tak, aby dłuższy bok zarodka był równoległy do dłuższego boku szkiełka nakrywkowego. Ustaw od 10 do 20 zarodków w jednym rzędzie.
- Usuń szkiełko nakrywkowe i umieść je w komorze suszenia na 3 do 8 minut (zależy to od wilgotności w pomieszczeniu i ilości do wstrzyknięcia).
- Umieść na metalowej komorze ze smarem próżniowym.
- Przykryj zarodki olejem halowęglowym 700, aby uniknąć dalszego odwodnienia. Zarodki są teraz gotowe do wstrzyknięcia.
4. Wstrzyknięcie zarodka
- Znajdź zarodki pod obiektywem 16x.
- Odsuń zarodki i znajdź igłę bez przesuwania płaszczyzny ogniskowej.
- Wyśrodkuj igłę i przesuń ją w górę, nie przesuwając jej w kierunku x lub y.
- Jeśli igła nie jest otwarta, umieść krawędź szkiełka nakrywkowego w polu view, ale nie w miejscu, w którym będzie igła, i opuść igłę do tej samej płaszczyzny ogniskowej. Bardzo ostrożnie przesuwaj szkiełko nakrywkowe, aż uderzy w igłę i delikatnie ją otworzy. Jeśli igła jest otwarta, przejdź do kroku 5. (Igły można otworzyć kwasem fluorowodorowym przed napełnieniem).
- Umieść zarodki w widocznym miejscu (ale nie tam, gdzie będzie igła), opuść igłę do oleju i upewnij się, że otrzymujesz ładne krople płynu z igły.
- Ostrożnie, ale systematycznie wsuń zarodek do igły i wstrzyknij kroplę do zarodka i odsuń zarodek. (Lub postępuj zgodnie z instrukcjami aparatu do wstrzykiwań).
- Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków są one gotowe do obserwacji pod mikroskopem konfokalnym.
