Test plamki świetlnej: metoda badania zachowania fototaktycznego Drosophila

Streszczenie

Źródło: Sun, Y., et al. Larwy Drosophila są wrażliwe na światło i reagują na zmiany w otaczającym świetle. Ten film opisuje test, który testuje ich zdolność do unikania światła, zwany testem plamki świetlnej. Prezentowany protokół pokazuje, jak skonfigurować test z niebieską diodą LED i pokazuje, jak rejestrować zachowanie zwierzęcia w odpowiedzi na spotkanie ze światłem.

Protokół

Ten tekst protokołu jest fragmentem z Sun et al., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp.(2019).

1. Konfiguracja systemu obrazowania

1. Zaciśnij kamerę internetową o wysokiej rozdzielczości za pomocą żelaznego klipsa, około 10 cm nad punktem świetlnym na pulpicie (Rysunek 1).
2. Dostosuj orientację obiektywu aparatu w kierunku pulpitu. Podłącz aparat do komputera za pomocą interfejsu USB.
3. Umieść płytkę agarową na pulpicie tuż pod aparatem.
4. Otwórz oprogramowanie "Amcap9.22" na komputerze z systemem Windows 7, a punkt świetlny zostanie automatycznie pokazany w oknie AMcap. Przesuń kamerę lekko w lewo lub w prawo, aby upewnić się, że plamka światła znajduje się blisko środka okna. Upewnij się, że kamera nie blokuje ścieżki światła. Plamka świetlna powinna być kompletna i okrągła.
   UWAGA: Oprogramowanie można znaleźć pod adresem http://amcap.en.softonic.com/.
5. Zamocuj filtr pasmowo-przepustowy 850 nm ± 3 nm za pomocą klipsa na 5-7 mm tuż pod kamerą.
   UWAGA: Średnica filtra wynosi około 2,5 cm, a obiektyw aparatu ma średnicę mniejszą niż 1 cm, dzięki czemu filtr może pokryć pole widzenia kamery. Gdy filtr znajduje się pod kamerą, plamka światła nie powinna być widoczna w oknie AMcap.
6. Umieść trzy diody LED generujące światło podczerwone (centralna długość fali = 850 nm) równomiernie wokół płytki agarowej. Każda dioda LED powinna znajdować się w odległości około 5 cm od krawędzi płytki agarowej, a czoło soczewki diody LED powinno być ustawione pod kątem 70° w dół w kierunku płytki agarowej. Podłącz diody LED do zasilania za pomocą konwertera AC-DC.
   UWAGA: Lepiej jest ustalić pozycje i kąty diod LED światła podczerwonego, aby zapewnić spójność jasności pola w różnych próbach eksperymentalnych i ułatwić późniejsze przetwarzanie wideo.
7. Umieść czarną tablicę między komputerem a urządzeniem. Ustaw jasność ekranu komputera, aby światło ekranu komputera nie wpływało na eksperyment.
   UWAGA: Utrzymuj ciemne otoczenie podczas pomiaru długości fali lub natężenia światła.

2. Ustawianie parametrów obrazowania

1. Z menu oprogramowania AMcap wybierz Opcje | Urządzenie wideo | Format przechwytywania i ustaw rozmiar przechwyconego wideo w pikselach na 800 x 600 i liczbę klatek na sekundę na 60 kl./s.
2. Wyjmij filtr spod kamery, umieść linijkę pod kamerą i dostosuj ostrość kamery, aby linia skali była wyraźna i równoległa do szerokości pola widzenia wideo.
3. Kliknij opcję Przechwyć | Ustawiać | Przechwytywanie wideo, aby wybrać ścieżkę zapisu, kliknij przycisk Rozpocznij nagrywanie, nagraj rzeczywistą odległość odpowiadającą 600 pikselom i oblicz stosunek każdego piksela do rzeczywistej odległości.

3. Nagrywanie wideo zachowania unikającego światła

1. Utrzymuj temperaturę 25,5 °C przez wszystkie eksperymenty. W razie potrzeby kontroluj temperaturę w pomieszczeniu za pomocą klimatyzatora. Utrzymuj wilgotność na stałym poziomie 60% za pomocą nawilżacza.
2. Obejrzyj krótki film przedstawiający pozycję punktu świetlnego o nazwie "lightarea1". Następnie przesuń filtr 850 nm ± 3 nm z powrotem, aby zakryć obiektyw aparatu.
   UWAGA: Podczas rejestrowania zachowania larw obiektyw kamery jest pokryty filtrem 850 nm ± 3 nm, dzięki czemu plamka świetlna nie jest widoczna na filmie. Plamę świetlną można zrekonstruować na filmach z larwami, a później za pomocą Matlaba. Nie zmieniaj położenia kamery i unikaj zmiany stosunku każdego piksela do rzeczywistej odległości zmierzonej w kroku 2.3.
3. Włącz światło (tj. światło w pomieszczeniu) z dala od urządzenia eksperymentalnego. Zmniejsz światło tak nisko, jak to możliwe, o ile larwy są wyraźnie widoczne oczami. Wyjmij larwy z pożywki hodowlanej łyżką, delikatnie wybierz larwę w trzecim stadium rozwojowym i umyj ją do czysta wodą destylowaną. Uważaj, aby myć larwy pojedynczo, aby uniknąć zakłóceń spowodowanych głodem. Pojedynczy eksperyment wymaga co najmniej 20 larw.
4. Przenieś larwę na środek płytki agarowej umieszczonej pod kamerą w kroku 1.3. Delikatnie usuń nadmiar wody z larwy za pomocą pędzla lub użyj bibuły, aby usunąć wodę z larwy, aby zapobiec odbijaniu się światła pod soczewką. Wyłącz światło w pomieszczeniu i pozwól larwie zaaklimatyzować się przez 2 minuty w ciemnym otoczeniu.
5. Włącz światło LED, aby wygenerować światło podczerwone i delikatnie przeczesz larwę do środka płytki. Kiedy larwa zacznie czołgać się prosto, obróć płytkę, aby larwa skierowała się w stronę jasnego punktu. Upewnij się, że czołga się od samego początku, w przeciwnym razie może nie uzyskać dostępu do punktu świetlnego.
6. Kliknij opcję Przechwyć | Ustawiać | Przechwytywanie wideo, aby wybrać ścieżkę zapisu, a następnie kliknij Rozpocznij nagrywanie, aby nagrywać. Pozwól larwie czołgać się w kierunku punktu świetlnego, wejdź do punktu świetlnego, a następnie opuść punkt świetlny, aż znajdzie się prawie poza polem widzenia. Kliknij przycisk Zatrzymaj nagrywanie. Jeśli larwa odwróci się od jasnego punktu, zanim się zbliży, bezpośrednio kliknij Zatrzymaj nagrywanie.
7. Odsuń filtr od aparatu. Nagraj krótki film przedstawiający położenie plamki świetlnej o nazwie "lightarea2" i porównaj ją z pozycją "lightarea1", aby upewnić się, że pozycja punktu świetlnego nie zostanie zmieniona. Jeśli zaobserwuje się oczywistą zmianę położenia, odrzuć dane.

Wyniki

Rysunek 1: Konfiguracja eksperymentalna. (A) Schematyczne przedstawienie układu do szybkiego testu fototaksji larw na podstawie plamki świetlnej. Niebieskie linie reprezentują ścieżki światła widzialnego używanego jako stymulacja wzrokowa, a czerwone linie reprezentują ścieżki światła podczerwonego. Strzałki wskazują kierunek padania światła. Filtr pasmowo-przepustowy 850 nm przepuszcza światło podczerw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dioda LED emitująca światło podczerwone 850 nm ± 3 nm	Thorlabs, Stany Zjednoczone Ameryki	Pył zawieszony PM100A	Kompatybilne czujniki: fotodiodowe i termiczne Zakres mocy optycznej: od 100 pW do 200 W Dostępny zakres długości fali czujnika: 185 nm-25 μm Częstotliwość odświeżania wyświetlacza: 20 Hz Szerokość pasma: DC-100 kHz Zakres czujnika fotodiodyb: 50 nA-5 mA Zakres czujnika termoelektrycznegob: 1 mV-1 V
Przetwornica AC na DC	Thorlabs, Stany Zjednoczone Ameryki	S120VC	Rozmiar otworu: Ø9,5 mm Zakres długości fali: 200-1100 nm Zakres mocy: 50 nW-50 mW Typ detektora: Fotodioda Si (rozszerzona UV) Liniowość: ±0,5% Niepewność pomiaru: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
Filtr pasmowo-przepustowy	Thorlabs, Stany Zjednoczone Ameryki	Kontroler DC2100	Zakres prądu LED: 0-2 A Rozdzielczość prądu LED: 1 mA Dokładność prądu LED: ±20 mA Napięcie przewodzenia LED: 24 V Zakres częstotliwości modulacji: 0-100 kHz Sinus Wave Modulacja: Dowolna
Skolimowane niebieskie światło LED	ELP, Chińska Republika Ludowa	USBFHD01M	Max. Rozdzielczość: 1920x1080 F6,0 mm Czujnik: 1/2.7" CMOS OV2710
Kompaktowa konsola miernika mocy	Ocean Optics, Stany Zjednoczone	USB2000+(RAD)	Wymiary: 89,1 mm x 63,3 mm x 34,4 mm Waga: 190 g Detektor: Sony ILX511B (2048-elementowy liniowy krzemowy układ CCD) Zakres długości fali: 200-850 nm Czas integracji: 1 ms – 65 sekund (typowo 20 sekund) Zakres dynamiki: 8,5 x 10^7 (system); 1300:1 dla pojedynczego przejęcia Stosunek sygnału do szumu: 250:1 (pełny sygnał) Ciemny szum: 50 RMS zlicza Krata: 2 (250 – 800 nm) Szczelina: SLIT-50 Soczewka detektora: L2 Sortowanie zamówień: OFLV-200-850 Rozdzielczość optyczna: ~2,0 nm FWHM Światło rozproszone: <0,05% przy 600 nm; <0,10% przy 435 nm Złącze światłowodowe: jednożyłowe włókno SMA 905 do 0,22 z aperturą numeryczną
Sterownik LED o dużej mocy	Minhongshi, Chińska Republika Ludowa	MHS-48XY	Napięcie robocze: DC12V Centralna długość fali: 850nm
Kamera internetowa o wysokiej rozdzielczości	Thorlabs, Stany Zjednoczone Ameryki	Jednostka MWWHL4	Kolor: Ciepły biały Skorelowana temperatura barwowa: 3000 K Prąd testowy dla typowej mocy LED: 1000 mA Maksymalny prąd (CW): 1000 mA Przepustowość (FWHM): N/A Moc elektryczna: 3000 mW Kąt widzenia (pełny kąt): 120 ° < br / > Rozmiar emitera: 1 mm x 1 mm Typowa żywotność: >50 000 h Temperatura pracy (bez kondensacji): 0 do 40 °C Temperatura przechowywania: -40 do 70 °C Grupa ryzyka: RG1 – grupa niskiego ryzyka
Dioda LED Ciepła Biała	Mega-9, Chińska Republika Ludowa	Zobacz materiał BP850/22K	Ø25,4 (+ 0 ~ -0,1) mm Przepustowość: 22±3nm Szczytowa przepuszczalność: 80% Centralna długość fali: 850nm ±3nm
spektrometr	Noela Danjou	Amcap9.22	AMCap to aplikacja do robienia zdjęć i nagrywania filmów z zaawansowanymi funkcjami podglądu i nagrywania. Jest to aplikacja klasyczna przeznaczona dla komputerów z systemem Windows 7 SP1 lub nowszym. Obsługiwana jest większość urządzeń zgodnych z Video-for-Windows i DirectShow, niezależnie od tego, czy są to tanie kamery internetowe, czy zaawansowane karty przechwytywania wideo.
Standardowy czujnik mocy fotodiody	Super Smok, Chiny	YGY-122000	Wejście: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Wyjście: DC 12V 2A
Czujnik mocy cieplnej	Thorlabs, Stany Zjednoczone Ameryki	Zobacz materiał M470L3-C1	Kolor: Niebieski Nominalna długość fali: 470 nm Szerokość pasma (FWHM): 25 nm Maksymalny prąd (CW): 1000 mA Napięcie przewodzenia: 3,2 V Moc elektryczna (maks.): 3200 mW Rozmiar emitera: 1 mm x 1 mm Typowa żywotność: 100 000 godz Temperatura pracy (bez kondensacji): 0 do 40 °C Temperatura przechowywania: -40 do 70 °C Grupa ryzykab: RG2 – Grupa umiarkowanego ryzyka
Czujnik mocy cieplnej	Thorlabs, Stany Zjednoczone Ameryki	Zobacz materiał S401C	Zakres długości fali: 190 nm-20 μm Zakres mocy optycznej: 10 μW-1 W (3 Wb) Wejściowy rozmiar otworu: Ø10 mm Aktywny obszar detektora: 10 mm x 10 mm Maksymalna gęstość mocy optycznej: 500 W/cm2 (śr.) Liniowość: ±0,5%

powiedział: powiedział: