Rozwarstwienie gruczołu pierścieniowego larw: izolacja rozwojowych narządów endokrynnych od Drosophila

Streszczenie

Źródło: Imura, E., et al. Protokoły wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów z barwieniem immunologicznym u muszki owocowej Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film opisuje gruczoł pierścieniowy Drosophila, złożoną strukturę endokrynną ważną dla biosyntezy i wydzielania ekdysteroidów i innych hormonów. Przedstawiony protokół demonstruje jego rozwarstwienie, utrwalenie i barwienie immunologiczne.

Protokół

Ten protokół jest fragmentem z Imura et al., Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

UWAGA: Ogólny schemat protokołów jest pokazany w Rysunek 1.

1. Rozwarstwienie larwalnego gruczołu pierścieniowego (RG)

UWAGA: U D. melanogaster, który należy do cyklorrhaphous Diptera, PG znajduje się w obrębie złożonego narządu endokrynnego zwanego gruczołem pierścieniowym (RG, Rysunek 2D). Ponieważ niemożliwe jest, aby PG został chirurgicznie oddzielony od innych typów komórek (omówionych później), praktycznym celem jest wyizolowanie nienaruszonego, nieuszkodzonego RG przez rozwarstwienie.

1. Przygotowanie larw w odpowiednich stadiach rozwojowych
   UWAGA: Aby zsynchronizować etapy rozwojowe larw D. melanogaster, konieczne jest zbieranie jaj w wąskim oknie czasowym i zbieranie larw w odpowiednim czasie.
   1. Zbieraj jajka przez 2 godziny na talerzu agarowym z sokiem winogronowym w temperaturze 25 °C.
   2. Zebrać nowo wyklute larwy 1^st instar pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą kleszczy i przenieść je do małej fiolki zawierającej puree z drożdży standardowych/mąki kukurydzianej na muchy.
      UWAGA: Wiek larw jest reprezentowany przez "godziny po złożeniu jaj (hAEL)", "godziny po wykluciu (hAH)" lub "godziny po ekdyzie L3 (hAL3E)".
   3. W odpowiednim momencie zbierz zainscenizowane larwy za pomocą jednorazowej plastikowej pętli, aby uniknąć niepożądanych obrażeń. Aby zminimalizować różnicę w postępie rozwojowym larw w 3.^stadium rozwojowym, należy zebrać larwy 2. stadium w wieku 70 hAEL (48 hAH) i pozwolić im linieć w odstępach 2-godzinnych. Następnie zbierz larwy 3.^{stadium rozwojowe} w ciągu 2 godzin po ekdyzie L3; ta procedura daje 0-2 larwy hAL3E.
   4. Przenieść stadia larwy do naczynia wypełnionego solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
   5. Opłucz larwy PBS, aby usunąć resztki pokarmu z organizmu.
2. Zgrubna sekcja larw pod mikroskopem preparacyjnym
   1. Przytrzymaj haczyk na usta larwy za pomocą kleszczy. Odetnij ciało larwy w przedniej jednej trzeciej długości ciała za pomocą mikronożyczek.
   2. Przytrzymaj odcięty koniec przedniego ciała larwy jedną parą kleszczy. Używając drugiej pary kleszczy, delikatnie popchnij czubek głowy w kierunku wnętrza ciała; Ta procedura wywraca ciało larwy na lewą stronę.
      UWAGA: Ten krok można pominąć w przypadku sekcji 1 larw w stadium rozwojowym.
   3. Powtórz kroki 1.2.1-1.2.2 z dodatkowymi larwami przez 5-10 min.
      UWAGA: Liczba larw powinna być równa lub mniejsza niż 20, aby zaoszczędzić czas na rozebranie.
3. Utrwalanie i barwienie tkanek za pomocą immunohistochemii
   1. Umieścić przednią jedną trzecią ciał larw (krok 1.2.2) do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 500 μl roztworu utrwalającego (4% paraformaldehydu w PBS). Jednorazowo należy ustalić mniej niż 20 próbek, w przeciwnym razie PBS dołączony do utrwalonych próbek może spowodować niekorzystne rozcieńczenie utrwalacza. W celu rozbioru filetów usuń kroplę PBS, a następnie dodaj kroplę roztworu utrwalającego.
      UWAGA: W przypadku roztworu utrwalającego można użyć 3,7% formaldehydu lub 4% paraformaldehydu.
   2. Wypreparowane tkanki inkubować w roztworze utrwalającym przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) lub alternatywnie przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
   3. Zastąp roztwór utrwalający 500 μl PBS i szybko przepłucz próbki 3 razy. Przemyć próbki 500 μl 0,3% PBT (PBS + 0,3% etoksylowany oktylofenol) przez 15 minut na bujaku w temperaturze pokojowej. W celu rozbioru filetów należy usunąć szpilki owadów i przenieść próbki do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: W celu zwiększenia przepuszczalności przeciwciał do tkanek, próbki poddaje się działaniu 500 μl 2,0% PBT przez 1-2 godziny na kołysce w temperaturze pokojowej.
   4. Zastąp PBT 500 μl roztworu blokującego (2% albuminy surowicy bydlęcej w PBT). Próbki należy inkubować przez 1,5 godziny na kołysce w temperaturze pokojowej.
   5. Zastąp roztwór blokujący 50 μl roztworem przeciwciał pierwszorzędowych, tj. przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze blokującym.
   6. Próbki należy inkubować przez noc na bujaku w temperaturze 4 °C.
   7. Zastąp pierwszorzędowy roztwór przeciwciała 500 μl 0,3% PBT i szybko przepłucz próbki 5 razy. Przemyj próbki 3 razy 500 μl 0,3% PBT przez 15 minut każda na bujaczku w temperaturze pokojowej.
   8. Zastąp 0,3% PBT 50 μl roztworem przeciwciała drugorzędowego (przeciwciała sprzężone z barwnikiem rozcieńczone w roztworze blokującym). Do barwienia jądrowego 0,5 μl 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI, 0,1 mg/ml roztworu podstawowego) dodaje się do 50 μl roztworu. Próbki inkubować na bujaku przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub alternatywnie w temperaturze 4 °C przez noc.
      UWAGA: Próbki należy przechowywać w ciemności.
   9. Zastąp roztwór przeciwciała 500 μl 0,3% PBT i spłucz 5 razy. Przemyć próbki 3 razy 500 μl 0,3% PBT przez 15 minut każda w temperaturze pokojowej.
4. Dokładna sekcja kompleksu mózg-RG zawierającego PG i montaż
   1. Użyj jednorazowej pipety, aby przenieść próbki wybarwione immunologicznie do naczynia wypełnionego 0,3% PBT.
      UWAGA: Aby uniknąć niewygodnych pęcherzyków powietrza podczas preparowania i montażu, 0,3% PBT można zastąpić PBS.
   2. Pod mikroskopem preparacyjnym przytrzymaj naskórek lub haczyk do ust jedną parą kleszczy. Używając igły 27 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml jako "noża", odetnij przedni koniec przełyku i krążki oka, aby usunąć kompleks dysk mózg-RG-oko z naskórka ciała.
   3. Oddziel przełyk i jelito od kompleksu mózg-RG-dysk oko za pomocą kleszczy. Ponieważ przełyk przechodzi przez mózg powyżej brzusznego rdzenia nerwowego (VNC), wyciągnij jelito na tylną stronę.
      UWAGA: Aby usunąć dodatkowe wyimaginowane dyski z próbek, przetnij połączenia między mózgiem, dyskami oczu i dyskami nóg za pomocą noża do igieł.
   4. Powtórz kroki 1.4.1-1.4.4 dla innych próbek.
      UWAGA: Aby zapobiec przywieraniu resztek tkanek do próbek, każdą wypełnioną próbkę należy przenieść do innego czystego naczynia wypełnionego 0,3% PBT lub PBS.
   5. Przenieść próbki do środka czystego szkiełka za pomocą mikropipety.
      UWAGA: W przypadku larw w 2. lub 3. stadium rozwojowym koniec końcówki mikropipety należy obciąć żyletką.
   6. Pod mikroskopem preparacyjnym wyrównaj poszczególne próbki grzbietową stroną do góry za pomocą kleszczy.
      UWAGA: RG znajduje się po grzbietowej stronie mózgu (Rysunek 2A). To wyrównanie ułatwia specyfikację poszczególnych próbek podczas obrazowania.
   7. Przechyl szklane szkiełko i zetrzyj jak najwięcej nadmiaru PBT. Umieść kroplę odczynnika montażowego z boku szkiełka. Umieść krawędź szkiełka nakrywkowego z drugiej strony kropli i powoli nakładaj szkiełko nakrywkowe na próbki za pomocą kleszczyków.
      UWAGA: Procedura ta zapobiega przemieszczaniu się próbek poza szkiełko nakrywkowe.
   8. Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C. Przechowywać próbki w ciemności.

Wyniki

Rysunek 1: Ogólny schemat protokołów. Dwie różne metody preparacji mają zastosowanie do larw i dorosłych samic, w zależności od celu eksperymentów. Metody montażu są również opracowywane w zależności od warunków próbki. Techniki utrwalania, barwienia i obrazowania są w zasadzie wspólne dla wszystkich próbek. Kliknij tutaj, aby zobac...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolekcja jaj
Naczynie do hodowli tkankowej (55 mm)	JAKO JEDNOŚĆ	Numer katalogowy: 1-8549-02	Na talerze agarowe z sokiem winogronowym
kubek do zbierania	HIKARI KAGAKU
pasta drożdżowa	Drożdże orientalne suszone, Tokio
100% sok winogronowy	Firma Welch Food Inc.
Hodowla larw
małe fiolki (12 ml, 40×23,5 mm, PS)	SARSTEDT (w	58 487
jednorazowa pętla	JAKO JEDNOŚĆ	6-488-01
Standardowy pokarm dla much			Przepis znajduje się na stronie internetowej centrum zapasów w Bloomington.
Rozwarstwienie
mikroskop preparacyjny	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
mikroskop preparacyjny	Księga Leica	S8 AP0
Naczynie do hodowli tkankowej (35 x 10 mm, niepoddane obróbce)	IWAKI	Numer katalogowy: 1000-035
Sylgard	TORAY		Krzem do cerkowania wewnątrz naczyń
Igła Terumo (27G, 0,40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	"Nóż" do cięcia tkanki
kleszcze, Inox, #5	Dumont, Szwajcaria
szpilka do owadów (średnica 0,18 mm)	Marka Shiga		do rozwarstwiania polędw
mikro nożyczki	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
Utrwalenie
Woda ultraczysta	Merck Millipore
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
Formaldehyd	Teski Nacalai	Numer katalogowy: 16222-65
Paraformaldehyd	Teski Nacalai	Numer katalogowy: 02890-45
Tryton-X100	Teski Nacalai	35501-15
mikroprobówki (1,5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Inkubacja
Jako jeden mikser swist TM-300 (rocker)	Jak jeden mąż	TM-300	Rocker
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	9048-46-8
Przeciwciało pierwszorzędowe
anty-Sro (świnka morska), 1:1000
anty-GFP (królik), 1:1000	Sondy molekularne	Ciągnik hamulcowy A6455	Shimada-Niwa i Niwa, 2014
anty-GFP (mysie mAb, GF200), 1:100	Nakarai tesque	Numer katalogowy: 04363-66
anty-5HT (królik), 1:500	Sigma	Zobacz materiał S5545
anty-Hts 1B1 (mysz)	Studia Rozwojowe Hybridoma Bank (DSHB)	Pozycja 1B1
anty-DE-kadheryna (szczur), 1:20	Magazyn DSHB	Kontroler DCAD2
Anty-NC82 (mysz), 1:50	Magazyn DSHB	Zobacz materiał NC82
Przeciwciało drugorzędowe
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 488	Technologie życiowe	A-11008
Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H+L), koniugat Alexa Fluor 488	Technologie życiowe	A-11001
Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-Rat IgG (H+L), koniugat Alexa Fluor 546	Technologie życiowe	A-11081
Kozie przeciwciało anty-gwinejskie IgG (H+L) Przeciwciało drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 555	Technologie życiowe	A-21435
Alexa Fluor 546 falloidyna sprzężona z barwnikiem	Technologie życiowe	A-22283
Odczynniki do montażu
Szkło mikroprzesuwne	Matsunami Glass Ind., Sp. z o.o.	Zobacz materiał SS7213
Kwadratowa szklana osłona mikroskopu	Matsunami Glass Ind., Sp. z o.o.	C218181
Odczynnik FluorSave (odczynnik montażowy)	Calbiochem (Elektrownia Jądrowa)	345789
Pipeta transferowa 1 ml (jednorazowy zakraplacz)	Watson	5660-222-1S
Kolby muchowe
w; GMR45C06-GAL4			z Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
Bezzałogowe statki powietrzne – GFP; Bezzałogowy statek powietrzny–mCD8::GFP			upominki od K. Ito, Uniwersytet Tokijski.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) i Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP			z Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			z Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)