Ten protokół jest fragmentem z Chattopadhyay et al., Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2012).
1. Test lokalnej sondy ciepła
Dostarczamy szkodliwy bodziec termiczny do pojedynczego segmentu ciała larwy za pomocą specjalnie skonstruowanej sondy termicznej wyprodukowanej przez Pro-Dev Engineering (zobacz Tabelę materiałów). Chociaż sonda ta ma optymalne cechy konstrukcyjne (mała metalowa końcówka o powierzchni ~,07mm2 i możliwość precyzyjnego utrzymania temperatury zadanej od 23 °C do 65 °C), w zasadzie każde narzędzie z małą końcówką, które można podgrzać do określonej temperatury przez okres do 20 sekund, powinno wystarczyć. Końcówka sondy służy do stymulacji wczesnych larw w trzecim stadium precyzyjnie na grzbietowej linii środkowej w segmencie brzusznym A4 (patrz Rysunek 1). W odpowiedzi na ten bodziec termiczny larwy na ogół wykazują awersyjne zachowanie wycofania, polegające na przewracaniu się na boki o 360 stopni lub więcej. To zachowanie różni się od ich lekkiej reakcji na dotyk na nieszkodliwą metalową sondę o temperaturze pokojowej, która zazwyczaj wiąże się z krótką przerwą w ich aktywności lokomotorycznej.
Protokół testu sondy cieplnej:
- Wstępnie ustawiona temperatura sondy termicznej na żądaną wartość zadaną.
- Za pomocą pędzla lub kleszczyków delikatnie przenieś pojedynczą larwę na płaską platformę (zwykle używamy małego kawałka winylu wyciętego ze spoiwa), na której larwy będą następnie stymulowane. Larwę należy przykryć cienką warstwą wody przed kontaktem z sondą termiczną. Warstwa wody pokrywająca larwę powinna być jak najmniejsza i całkowicie zakrywać larwę, jednocześnie upewniając się, że larwa nie jest sucha podczas dotykania winylu.
- Delikatnie dociśnij końcówkę sondy do larwy w segmencie A4, wywierając lekki nacisk końcówką pod kątem około 45° między sondą a powierzchnią larwy (patrz Rysunek 1). Nacisk powinien spowodować niewielkie wgłębienie na powierzchni larwy i zwykle będzie wystarczający, aby zapobiec poruszaniu się. Jeśli larwa nadal się porusza, zastosuj nieco większy nacisk, a zwykle się zatrzyma. Nie zapisuj danych od larw, które przemieszczają się poza pole widzenia lub dla których nie można osiągnąć stałego kontaktu z sondą do czasu odpowiedzi lub odcięcia 20 sekund.
- Kontynuuj stymulację larwy do momentu wystąpienia reakcji odstawienia lub do osiągnięcia 20-sekundowej wartości granicznej, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Reagujące larwy zazwyczaj najpierw wykazują wstępne zachowanie polegające na podnoszeniu głowy i ogona. Po tym zwykle następuje zachowanie wycofujące polegające na przetaczaniu się o co najmniej 360 stopni. Tylko pełny rzut o 360 stopni jest oceniany jako zachowanie nocyfencywne (wstępne podniesienie orła lub reszki nie jest).
- Po zainicjowaniu zachowania związanego z wycofaniem zwolnij kontakt z sondą i zapisz opóźnienie lub czas do wycofania. Jeśli w ciągu 20 sekund nie zostanie zaobserwowane żadne zachowanie związane z odstawieniem, oznacza to, że larwa nie reaguje. Responderów można dalej podzielić na 2 kategorie. Jeśli zachowanie podczas odstawienia zostanie pokazane w ciągu 5 sekund, oznacza to, że larwa szybko reaguje. Jeśli zachowanie związane z odstawieniem jest wykazywane między 5-20 sekundami, oznacza to, że larwa reaguje wolno (patrz Rysunek 1 w Babcock et al., Curr. Biol. (2009)).
