Ten protokół jest fragmentem Liu et al. Test gradientu temperatury w celu określenia preferencji termicznych larw Drosophila, J. Vis. Exp. (2018).
1. Ustawienie gradientu temperatury
- Przygotowanie gradientu jednokierunkowego
- Aby stworzyć wilgotne środowisko otoczenia podczas testów, umieść dwa aluminiowe bloki połączone z dwiema kąpielami wodnymi na mokrych ręcznikach papierowych, oddalonych od siebie o 10 cm (Rysunek 1A).
- Włącz dwie łaźnie wodne ~ 2 godziny przed rozpoczęciem testu, aby dać wystarczająco dużo czasu na wyrównanie temperatury bloków aluminiowych.
UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie próbnego eksperymentu w celu określenia temperatury każdej kąpieli wodnej, która jest potrzebna do osiągnięcia pożądanego liniowego gradientu temperatury. Niektóre typowe pary temperatur do ustawiania kąpieli wodnych są wymienione w tabeli 1. Należy jednak pamiętać, że na temperaturę powierzchni ma wpływ temperatura otoczenia. Długość rurki również wpływa na temperaturę, ponieważ w rurkach występuje chłodzenie. Długość rurki w naszej konfiguracji wynosi 1,5 m.
- Kuchenkę mikrofalową 100 ml 1% agarozy przy ustawieniu wysokiej mocy w okrągłej butelce o pojemności 500 ml z szeroką szyjką i wlać 25 ml / płytkę testową na płaskim blacie. Przygotuj dwie płytki testowe, które można umieścić na aluminiowych blokach w tym samym czasie (Rysunek 1A).
- Po zastygnięciu agarozy (10-20 min) delikatnie przetrzyj każdą powierzchnię agarozy standardową gąbką kuchenną lub gąbką melaminową, aby powierzchnia agarozy była lekko szorstka, tak aby podczas rozpylania wody na żel agarozowy powstała gładka cienka membrana wodna i nie tworzyły się kropelki wody.
- Całkowicie zanurz płytki w pojemniku z wodą destylowaną, aż test będzie gotowy do wykonania, aby zapobiec wysuszeniu płytek.
- Przygotuj gradient dwukierunkowy (opcjonalnie)
- Aby stworzyć wilgotne środowisko otoczenia podczas testów, umieść trzy aluminiowe bloki w odległości 8 cm od siebie (Rysunek 1B) na mokrych ręcznikach papierowych.
- Włącz dwie łaźnie wodne ~ 2 godziny przed rozpoczęciem testu, aby dać wystarczająco dużo czasu na wyrównanie temperatury bloków aluminiowych.
UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie próbnego eksperymentu w celu określenia temperatury każdej kąpieli wodnej dla gradientu dwukierunkowego. Niektóre typowe pary temperatur do ustawiania łaźni wodnych są wymienione w tabeli 2. Należy jednak pamiętać, że na temperaturę powierzchni ma wpływ temperatura otoczenia. Długość rurki również wpływa na temperaturę, ponieważ w rurkach występuje chłodzenie. Długość rurki w naszej konfiguracji wynosi 1,5 m.
- Aby zapobiec wysypywaniu się agarozy z płyty, owiń krawędzie aluminiowej płyty taśmą do etykietowania, aby utworzyć ściankę o wysokości 10 mm (Rysunek 1B).
- Korzystając z ustawienia wysokiej mocy, podgrzej w kuchence mikrofalowej 200 ml 1% agarozy w okrągłej butelce o pojemności 500 ml z szeroką szyjką i wlej 120 ml na płytkę testową.
- Po zastygnięciu agarozy (~30 min) delikatnie przetrzyj każdą powierzchnię agarozy standardową gąbką kuchenną lub gąbką melaminową, aby powierzchnia agarozy była lekko szorstka, tak aby podczas rozpylania wody na żel agarozowy powstała gładka cienka membrana wodna i nie tworzyły się kropelki wody.
- Całkowicie zanurz płytki testowe w pojemniku z wodą destylowaną, aż test będzie gotowy do wykonania, aby zapobiec ich wysychaniu.
- Ustawianie gradientu jednokierunkowego
- Przygotować odczynniki i przedmioty na stole obok aparatury do oznaczania gradientu (patrz Tabela materiałów).
- Aby zapewnić wydajny transfer temperatury, wypełnij wszelkie szczeliny między blokami aluminiowymi a płytkami testowymi, rozpylając wodę na granicy między blokami a płytą.
- Za pomocą rękawic wyjmij płytki testowe z pojemnika na wodę. Jeśli woda dostanie się między żel agarozowy a płytkę i spowoduje powstanie guzków na powierzchni, usuń wodę za pomocą mikropipety P1000.
- Umieść płytki testowe na blokach aluminiowych tak, aby rozgraniczenia znajdujące się 2 cm od każdej krawędzi dokładnie pokrywały się z krawędziami bloków aluminiowych (Rysunek 1A,C).
- Spryskaj powierzchnię płytki wodą (wystarczy cienka membrana wodna pokrywająca powierzchnię agarozy), aby zapobiec wysychaniu żelu agarozowego. Upewnij się, że membrana wodna jest ciągła i wolna od kropelek wody, ponieważ larwy mogą zostać uwięzione w kropelkach wody.
- Przykryj system gradientowy kartonowym pudełkiem, aby zmniejszyć parowanie wody i pomóc ustabilizować temperaturę powierzchni żelu. Odczekaj 5-10 minut, aby temperatura się wyrównała.
- Sprawdź temperaturę powierzchni w 12 punktach na tabliczce (Rysunek 1C). Wykonaj dwa pomiary w każdej strefie, aby ustalić, czy istnieje zmienność w strefie. Upewnij się, że temperatura w obu miejscach mieści się w zakresie ± 0.2 °C od żądanej temperatury.
UWAGA: Zmienność w obrębie strefy zwykle występuje, ponieważ dokładne odległości dwóch punktów do krawędzi aluminiowych bloków nie są identyczne. Dostosuj położenie płyty na aluminiowych blokach, aby upewnić się, że rozgraniczenia znajdujące się 2 cm od dowolnej krawędzi dokładnie pasują do krawędzi aluminiowych bloków.
- Jeśli zmierzony gradient temperatury odbiega od pożądanego gradientu, zwiększ lub zmniejsz ustawienie temperatury łaźni wodnej i ponownie sprawdź temperaturę powierzchni po ustabilizowaniu się temperatury łaźni wodnej.
- Przykryj system gradientu kartonowym pudełkiem do momentu rozpoczęcia testu.
- Ustawianie gradientu dwukierunkowego (opcjonalnie)
- Przygotować odczynniki i przedmioty na stole obok aparatury do oznaczania gradientu (patrz Tabela materiałów).
- Rozpyl wodę na powierzchnie trzech bloków aluminiowych, aby zapewnić wydajny transfer temperatury z bloków aluminiowych na płytki testowe, wypełniając wszelkie szczeliny między powierzchniami.
- Ostrożnie wyjmij płytki testowe z pojemnika na wodę i umieść je na aluminiowych blokach. Jeśli woda dostanie się między żel agarozowy a płytkę, co może spowodować powstanie guzków na powierzchni, usuń wodę za pomocą mikropipety P1000.
- Umieść płytkę testową na aluminiowych blokach tak, aby linie środkowe pierwszej i ostatniej strefy z dowolnej krawędzi dokładnie pokrywały się z krawędziami dwóch bocznych bloków aluminiowych (Rysunek 1B, D).
- Spryskaj powierzchnię płytki wodą (wystarczy cienka membrana wodna pokrywająca powierzchnię agarozy), aby zapobiec wysychaniu żelu agarozowego. Upewnij się, że membrana wodna jest ciągła i wolna od kropelek wody, ponieważ larwy mogą zostać uwięzione w kropelkach wody.
- Przykryj system gradientowy kartonowym pudełkiem, aby zmniejszyć parowanie wody i pomóc ustabilizować temperaturę powierzchni żelu. Odczekaj 5-10 minut, aby temperatura się wyrównała.
- Sprawdź temperaturę powierzchni w dwóch punktach wzdłuż linii środkowej każdej z 10 stref (Rysunek 1D). Wykonaj dwa pomiary w każdej strefie, aby ustalić, czy istnieje zmienność w strefie. Upewnij się, że temperatura w obu miejscach mieści się w zakresie ± 0.2 °C od żądanej temperatury.
UWAGA: Zmienność w obrębie strefy zwykle występuje, ponieważ dokładne odległości dwóch punktów do krawędzi aluminiowych bloków nie są identyczne. Dostosuj położenie płyty na aluminiowych blokach, aby upewnić się, że linie środkowe pierwszej i ostatniej strefy najbliżej każdej krawędzi dokładnie pokrywają się z krawędziami dwóch bocznych bloków aluminiowych.
- Jeśli zmierzony gradient temperatury odbiega od żądanego gradientu, wyreguluj ustawienie temperatury łaźni wodnej i ponownie sprawdź temperaturę powierzchni po ustabilizowaniu się temperatury łaźni wodnej.
- Przykryj bloki kartonowym pudełkiem do momentu rozpoczęcia testu.
2. Test i obliczenia
- Wyjmij karton i sprawdź temperaturę powierzchni żelu bezpośrednio przed przeniesieniem larw na płytkę. Zminimalizuj czas, w którym karton jest otwarty, aby zapobiec zakłóceniu równowagi temperatury. Jeśli powierzchnia jest sucha, spryskaj ją niewielką ilością wody.
- Rozmieść od 150 ± 50 larw w pobliżu środka każdej płytki (między strefami 3 i 4 z 6 stref) dla gradientu jednokierunkowego (strefa uwalniania; Rysunek 1C).
UWAGA: W przypadku gradientu dwukierunkowego rozmieść 200-400 larw wzdłuż środkowej strefy każdej połówki (Rysunek 1D).
- Umieść pokrywkę mikropłytki na każdej płytce testowej, aby zapobiec wypełzaniu larw. Przykryj zestaw kartonowym pudełkiem, aby zapobiec ekspozycji na światło, która może wpłynąć na wybór larw na żelu agarozowym.
UWAGA: W przypadku gradientu dwukierunkowego nie powinno być konieczne przykrywanie płytki pokrywką, ponieważ płytka jest większa, a preferowana temperatura larw znajduje się w strefie środkowej. W związku z tym niewiele larw gromadzi się na krawędziach i ma możliwość wyczołgania się.
- Pozostawić test na 10-30 minut w przypadku gradientu jednokierunkowego i na 15-35 minut w przypadku gradientu dwukierunkowego, w zależności od wieku larw (tabela 3).
- Wyjmij pudełko tekturowe i pokrywkę mikropłytki. Sfotografuj tablice z góry za pomocą aparatu cyfrowego. Zrób dwa zdjęcia każdej płytki testowej, aby badacz mógł wybrać tę o lepszym kontraście i jasności do analizy.
- Usunąć wszystkie larwy z płytek testowych i w dowolnym miejscu poza płytkami przez aspirację.
- Dokładnie oczyścić płytki testowe, probówki i sitko do komórek wodą destylowaną. Ponownie użyć płytek do oznaczania przygotowanych tego dnia, chyba że powierzchnia agarozy jest uszkodzona.
- Oblicz procentowy rozkład larw w każdej strefie.
- Otwórz obraz fotograficzny wyników testu za pomocą dowolnego oprogramowania, które umożliwia dodawanie oznaczeń do obrazu. Aby wskazać strefy oznaczania, należy narysować pionowe linie co 2 cm w oparciu o rozgraniczenia na tabliczce testowej.
- Policz liczbę larw w każdej strefie i zapisz liczby. Nie licz larw w obszarach oddalonych o 0,5 cm od którejkolwiek ze ścian. Żel jest grubszy w pobliżu ścian, a temperatury powierzchni nie są liniowe w tych regionach.
- W przypadku gradientu jednokierunkowego oblicz rozkład procentowy w każdej strefie w następujący sposób:
(liczba larw w danej strefie 2 cm)/ (łączna liczba larw w 6 strefach) x 100.
- Dla gradientu dwukierunkowego oblicz rozkład procentowy w każdej strefie w następujący sposób:
(liczba larw w danej strefie 2 cm)/ (całkowita liczba larw w 5 strefach po każdej stronie gradientu) x 100.
