Ten protokół jest fragmentem z Vogler and Ocorr, Visualizing the Beating Heart in Drosophila, J. Vis. Exp. (2009).
1. Zanim zaczniesz
- Świeżo przygotowany sztuczny roztwór hemolimfy (AH) zawierający 108mM Na+, 5mM K+, 2mM Ca2+, 8mM MgCl2, 1mM NaH2PO4, 4mM NaHCO3, 10mM sacharozy, 5mM trehalozy, 5mM HEPES (pH 7,1, wszystkie odczynniki firmy Sigma Chemicals). Sacharoza i trehaloza powinny być dodane do AH z chłodzonych roztworów podstawowych tuż przed użyciem, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu.
- Doprowadź AH do temperatury pokojowej i natlenić roztwór przez bulgotanie powietrzem przez co najmniej 15 minut.
- Pociągnij kilka drobnych naczynek (np. Glass Capillaries, 100ul, VWR) wymaganych do usunięcia tłuszczu.
2. Na wpół nienaruszone serce Drosophila od dorosłej muchy
- Dorosłe muchy Drosophila są znieczulane preparatem Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) przez 2-5 minut. Należy uważać, aby nie pozostawiać much w Fly Nap na dłuższe ekspozycje. Krótkotrwała ekspozycja na zimno może być również wykorzystana do znieczulenia much, ale CO2 nie jest zalecany, ponieważ ma długotrwały wpływ na tętno i rytmiczność.
- Znieczulone muchy umieszcza się grzbietem do dołu na szalce Petriego pokrytej cienką warstwą wazeliny. Hydrofobowy naskórek na skrzydłach i ciele odwracalnie "przykleja się" do galaretki, ale w razie potrzeby muchę można przestawić. Staje się to szczególnie ważne podczas kolejnych manipulacji.
- Wstępne cięcie wykonuje się za pomocą zakrzywionych nożyczek sprężynowych (Roboz #5611). Ostrza nożyc umieszcza się pod nogami i kieruje w dół w kierunku grzbietowej powierzchni klatki piersiowej w pobliżu szyi. Głowa, brzuszny rdzeń nerwowy i nogi są usuwane jednym cięciem. Preparat jest następnie zanurzany w natlenionym, sztucznym roztworze hemolimfy (AH).
- Za pomocą nożyczek sprężynowych tylny koniec brzucha (składający się z segmentów brzusznych 7 i 8) usuwa się jednym cięciem. Zapewnia to dostęp do wykonywania bocznych nacięć wzdłuż obu krawędzi brzucha i służy do przerwania połączenia między tylnym jelitem a naskórkiem brzucha. Uwolniony płat brzusznego naskórka brzusznego jest następnie usuwany.
- W krokach 3 i 4 przednie i tylne połączenia jelita są przerywane, więc narządy jamy brzusznej są teraz utrzymywane na miejscu tylko przez tracheole. Jelita i inne narządy jamy brzusznej można zwykle usunąć jako pojedynczą masę za pomocą kleszczy jubilerskich (Roboz, #55) i delikatnego szarpania. Usunięcie narządów wewnętrznych odsłania bijącą rurkę serca, która nadal jest przyczepiona do naskórka grzbietowego, otoczona ciałami tłuszczowymi.
- Ciała tłuszczowe są dość nieprzezroczyste w mikroskopie świetlnym, w związku z czym często konieczne jest usunięcie części tego tłuszczu, aby wyraźnie zobaczyć rurkę serca. Osiąga się to za pomocą techniki liposukcji przy użyciu drobno narysowanych szklanych naczyń włosowatych. Kapilary wykonuje się za pomocą standardowego ściągacza do pipet (np. Sutter P-97 Pipette Puller), a następnie wkłada się je do plastikowej rurki (Tygon, 1/16") podłączonej do źródła podciśnienia. System ten służy do odsysania nadmiaru tłuszczu z okolic rurki serca. Siła ssania jest proporcjonalna do średnicy końcówki, dlatego nie należy używać pipet z końcówkami o średnicy większej niż 40 mikronów. Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć dotykania samego serca, a ponieważ tylna część serca jest bardzo delikatna, należy całkowicie unikać tego obszaru.
- Dorosła rurka serca Drosophila jest teraz odsłonięta i powinna bić. W razie potrzeby naskórek i przyczepione serce można zmienić, delikatnie podnosząc naskórek z wazeliny i ostrożnie ubijając go z powrotem, ponownie unikając kontaktu z tkanką serca. W tym momencie roztwór kąpiący preparat należy zastąpić świeżym AHL. Preparat ten należy pozostawić do zrównoważenia przez 20-30 minut z natlenieniem przed jakimikolwiek manipulacjami. Jeśli preparat ma być przechowywany dłużej niż 60 minut, należy go przetworzyć świeżym AHL.
