C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie blastomerów: metoda usuwania skorupki jaja i dysocjacji komórek embrionalnych

Streszczenie

Źródło: Hsu, C. R., et al. In vitro Rekonstrukcja przestrzennych wzorców kontaktu komórek z izolowanymi zarodkami Caenorhabditis elegans, blastomerami zarodkowymi i adhezyjnymi kulkami polistyrenu.J. Vis. Exp.(2019).

Ten film przedstawia metodę izolowania blastomerów C. elegans z wczesnych zarodków. Otrzymane komórki nadają się do hodowli komórkowej lub eksperymentów ex vivo.

Protokół

Ten protokół jest fragmentem Hsu et al, In Vitro Rekonstrukcja przestrzennych wzorców kontaktu komórek z izolowanymi zarodkowymi blastomerami Caenorhabditis elegans i adhezyjnymi kulkami polistyrenu, J. Vis. Exp.(2019).

1. Izolacja blastomeru zarodka
2. Nosić rękawice i fartuch laboratoryjny, aby uniknąć skaleczenia i kontaktu z roztworem wybielającym.
   1. Trzymaj każdy koniec mikrokapilary (pojemność; 10 μl) prawą i lewą ręką.
   2. Pociągnij mikrokapilę w kierunku obu końców, aby wywrzeć napięcie i przesuń środek kapilary nad palnik, aby utworzyć dwie ręcznie ciągnięte kapilary (Rysunek 1A).
   3. Przyciąć końcówki ręcznie ciągniętych naczyń włosowatych kleszczami pod mikroskopem preparacyjnym i przymocować wyciągniętą kapilarnę do aparatu do pipetowania jamy ustnej. Przygotuj dwa rodzaje pipet. Rozmiary otworów końcówek pipet powinny wynosić około 2 i 1 razy więcej długości krótkiej osi zarodków C. elegans (30 μm) w przypadku transferu zarodków i usuwania skorupek jaj, odpowiednio Rysunek 1B-D).
   4. Odpipetować 45 μl roztworu soli jaja na studzienkę szkiełka wielodołkowego (Rysunek 2A; na dole).
   5. Umieść 5-10 dorosłych C. elegans w studzience zawierającej roztwór soli jajecznej.
   6. Aby uzyskać wczesne zarodki C. elegans, należy pociąć dorosłe osobniki na kawałki, umieszczając dwie igły po prawej i lewej stronie ciała C. elegans i przesuwając igły obok siebie (ryc. 2A; górny schemat).
   7. Pobrać pipetą 45 μl roztworu podchlorynu do studzienki obok studzienki zawierającej roztwór soli jaj (ryc. 2B).
   8. Odpipetować 45 μl pożywki wzrostowej Sheltona do kolejnych trzech studzienek obok studzienki zawierającej roztwór podchlorynu (ryc. 2B).
   9. Przenieś zarodki w stadium 1-komórkowym i wczesne stadium 2-komórkowe do roztworu podchlorynu za pomocą pipetowania doustnego za pomocą ręcznie narysowanej kapilary do transferu zarodków (ryc. 2B).
   10. Poczekaj 40–55 sekund.
   11. Umyj zarodki, przenosząc je z roztworu podchlorynu do pożywki wzrostowej Sheltona za pomocą doustnego pipetowania za pomocą ręcznie narysowanej kapilary do transferu zarodków (ryc. 2B).
   12. Ponownie umyj zarodki, przenosząc je do nowego dołka pożywki wzrostowej Sheltona, pipetując doustnie za pomocą ręcznie narysowanej kapilary do transferu zarodków (ryc. 2B).
   13. Przenieś umyte zarodki do nowego dołka pożywki Sheltona za pomocą doustnego pipetowania za pomocą ręcznie narysowanej kapilary do transferu zarodków. Używając ręcznie narysowanej kapilary do usuwania skorupki jajka, ostrożnie powtórz pipetowanie (rysunek 2C; środkowy schemat). Jeśli skorupka jaja zostanie pomyślnie usunięta, komórki embrionalne staną się bardziej kuliste (ryc. 2C; po prawej).
   14. Oddziel blastomery embrionalne w stadium 2-komórkowym, delikatnie i w sposób ciągły pipetując ręcznie narysowaną kapilarą w celu usunięcia skorupki jaja (ryc. 2D).

Rysunek 1: Izolacja blastomerów.(A) Ręczne ciągnięcie szklanej kapilary. (B) Ręcznie rysowana szklana kapilara do transferu zarodków. (C) Ręcznie rysowana szklana kapilara do usuwania skorupek jaj. (D) Schematy przedstawiające odpowiednią wielkość otworu kapilarnego do usunięcia skorupki jaja. Strzałki wskazują zarodki. Podziałka skali pokazuje 100 μm.

Rysunek 2: Przebieg izolacji blastomerów.(A) Sekcja dorosłych C. elegans w buforze soli jaj w celu uzyskania zarodków. Fotografie pokazują zarodki w stadium 2-komórkowym i 4-komórkowym przed usunięciem skorupki jaja. (B) Obróbka podchlorynem i mycie. (C) Schematy przedstawiają odpowiedni moment usunięcia skorupki jaja. Zdjęcie przedstawia zarodek w stadium 4-komórkowym po usunięciu skorupki jaja. (D) Separacja blastomerów. Fotografia przedstawia oddzielony zarodek w stadium 2-komórkowym. Rozmiary strzałek w C i D wskazują względne siły wymagane podczas pipetowania. Paski skali pokazują 50 μm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zespół rurki aspiratora	Drummond	21-180-13	Do izolacji blastomerów.
Caenorhabditis elegans szczep: N2, typ dziki	Centrum Genetyki Caenorhabditis	N2	Szczep użyty w tym badaniu
Caenorhabditis elegans szczep: KSG5, genotyp: zuIs45; itIs37	w domu	Zobacz materiał KSG5	Szczep użyty w tym badaniu
Kalibrowane mikropipety, 10 μL	Drummond	21-180-13	Do izolacji blastomerów
CD Koncentrat lipidowy	Technologie życiowe	11905031	Do izolacji blastomerów. Praca w kapturze do hodowli tkankowych.
Clorox	Clorox	N. A.	Do izolacji blastomerów. Otwórz nową butelkę, gdy leczenie podchlorynem nie działa dobrze.
Uchwyt na szkiełko nakrywkowe	Na miejscu	Nie	Do izolacji blastomerów.
Mikroskop preparacyjny: Zeiss Stemi 508 ze statywem M. Źródłem światła jest wbudowana dioda LED. Powiększenie okularu wynosi 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	Do izolacji blastomerów.
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowany One Shot, pochodzenie z Kanady	Gibco (firma Gibco)	A3160701	Do izolacji blastomerów. Praca w kapturze do hodowli tkankowych.
igły podskórne ogólnego zastosowania i precyzyjnego ślizgu, rozmiar 25	Bd	14-826AA	Do izolacji blastomerów
inulina	Alfa Aesar	AAA1842509	Do izolacji blastomerów
MEM Roztwór witaminowy (100x)	Gibco (firma Gibco)	11120052	Do izolacji blastomerów.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedycyna	ICN6041805	Do izolacji blastomerów
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Gibco (firma Gibco)	15140148	Do izolacji blastomerów.
Poliwinylopirolidon	Odczynniki biologiczne Fisher	Zobacz materiał BP431-100	Do izolacji blastomerów
Chlorek potasu	Sklep biologiczny	Zobacz materiał POC888	Do izolacji blastomerów
Sterylne podłoże Drosophila Schneidera	Gibco (firma Gibco)	21720024	Do izolacji blastomerów. Praca w kapturze do hodowli tkankowych.
Chlorek sodu	Sklep biologiczny	SOD001	Do izolacji blastomerów
roztwór wodorotlenku sodu, 10 N	Fisher Chemiczny	Zobacz materiał SS255-1	Do izolacji blastomerów
Filtry strzykawkowe, PTFE, niesterylne	Basix (Język Basix)	13100115	Do izolacji blastomerów.
Tygon S3 Rurki laboratoryjne,, Formulacja E-3603, Średnica wewnętrzna 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	Do izolacji blastomerów.
Tygon S3 Rurki laboratoryjne,, Formulacja E-3603, Średnica wewnętrzna 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	Numer katalogowy: 89403-854	Do izolacji blastomerów.

dotyczy powiedział: