C. elegans (C. elegans) Test chemotaksji: metoda testowania chemosensacji u robaków

Streszczenie

Źródło: Campbell, J. C., et al. A Caenorhabditis elegans Test awersji do miedzi oparty na statusie żywieniowym. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film przedstawia chemotaksję u nicienia C. elegans i pokazuje przykładowy protokół testujący chemotaktyczną awersję do siarczanu miedzi.

Protokół

Poniższy protokół jest fragmentem Campbell i in., A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Przygotowanie organizmów doświadczalnych
   1. Na 24 godziny przed rozpoczęciem badania należy wybrać 10 nicieni w stadium L4 z każdego szczepu, aby upewnić się, że podczas badania organizmy są młodymi osobnikami dorosłymi. Dla każdego badanego mutanta lub nicienia kontrolnego należy wybrać 10 L4 (10 dla kontroli i 10 dla testu).
      1. Organizmy L4 należy utrzymywać przy użyciu standardowych metod przez 24 godziny na standardowych płytkach agarowych wysianych Escherichia coli OP50. Jeśli organizmy zostaną utracone podczas kolejnych etapów mycia, należy to zrekompensować, zwiększając początkową wielkość próbki (tj. wybrać 20 robaków zamiast 10).
         UWAGA: Zachowanie jest fenotypem z natury zmiennym. Metodę należy wykonać w trzech egzemplarzach dla każdego szczepu przez trzy oddzielne dni. Uwzględnij dodatkowe szczepy kontrolne i warunki dla nowych szczepów, jak podkreślono w sekcji dyskusji.
   2. Bezpośrednio przed badaniem przenieś organizmy doświadczalne na płytkę agarową bez bakterii i pozwól nicieniom swobodnie poruszać się przez 1 minutę w celu usunięcia nadmiaru bakterii.
      1. Jeżeli w ciągu 24 godzin poprzedzających badanie organizmy doświadczalne doświadczyły warunków skażenia, należy je wyrzucić.
   3. Odpipetować 1 ml M9 na płytkę wolną od bakterii, aby wypłukać robaki do probówki mikrowirówkowej.
   4. Wirować przy 3 000 x g przez 1 min. Robaki powinny uformować osad na dnie probówki. Zassać roztwór M9 bez naruszania osadu robaka. Dodaj 1 ml M9 do osadu robaka, odwróć probówkę, aby wymieszać robaki z roztworem.
   5. Powtórz kroki 1.4 jeszcze trzy razy.
      1. Jeśli nadmiar bakterii został początkowo przeniesiony wraz z robakami, powtórz w sumie 5 razy. Żadne bakterie nie powinny być przenoszone na miedziane talerze wyścigowe. Jeśli żywność zostanie przeniesiona na płytkę testową, będzie to przeszkadzać w dokładnym zbieraniu danych.
   6. Po ostatnim przepłukaniu odessać supernatant do 100 μl M9 i pozostać osad robaka.
      Uwaga: Zachowania związane z głodówką stają się widoczne po 30 minutach. W związku z tym robaki należy natychmiast przenieść z roztworu po zakończeniu etapów mycia.
2. Przygotowanie płytek testowych
   1. Przygotuj standardowe płytki agarowe NGM na dwa dni przed badaniem.
      1. Jeśli płytki są przechowywane w wilgotnym środowisku, należy je przygotować na 3 dni przed badaniem. Alternatywnie zdejmij pokrywkę płytki na 3 - 6 godzin, aby zapewnić odpowiednią suchość (jeśli w sterylnym środowisku).
   2. Za pomocą grubego markera permanentnego narysuj linię na spodniej stronie płytki wzdłuż zewnętrznej krawędzi i drugą, aby utworzyć barierę linii środkowej (ryc. 1). Bariera linii środkowej powinna znajdować się w równej odległości od każdej krawędzi płytki. Użyj linijki, aby zapewnić precyzyjne pomiary. Linie te będą służyć jako przewodnik podczas przenoszenia bakterii i roztworu miedzi. Pod warunkiem, że E. coli zostanie przeniesiona przed roztworem miedzi, linie te będą służyć jako wskaźniki.
   3. Talerz nasienny z 50 μl OP50 E. coli tylko po jednej stronie miedzianej bariery, aby stworzyć jednolity trawnik (rysunek 2). Stężenie bakterii powinno pozostać spójne we wszystkich testach; Zaobserwowano jednak niewielką zmienność w odpowiedzi na łagodne różnice w stężeniu.
      1. Użyj zaznaczonych linii na spodniej stronie płytki, aby upewnić się, że bakterie nie mają kontaktu z roztworem miedzi. Pod warunkiem, że roztwór miedzi wyściela krawędź płytki i tworzy barierę w linii środkowej, przenieś bakterie tak, aby roztwór miedzi nie miał kontaktu ze źródłem żywności.
   4. Zaznacz drugi zestaw płytek i nie przenoś do nich żadnych bakterii E. coli OP50 (ryc. 2). Płytki te posłużą do oceny kontroli ujemnej. Tabliczki te powinny być również oznaczone na jednej połowie tabliczki w celu wskazania początkowego miejsca przeniesienia.
   5. Pozostawić bakterie do wyschnięcia, a następnie inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc. Upewnij się, że plastry bakteryjne nie są naruszone podczas przenoszenia do inkubatora lub pomieszczenia o temperaturze 37 °C. Nadmierne zakłócenia mogą zmienić położenie lub kształt grządki z żywnością.
3. Test chemotaksji
   1. Świeżo przygotować 0,5 M roztwór siarczanu miedzi (II) przed rozpoczęciem oznaczania. Pod warunkiem, że na jedną płytkę stosuje się 125 μl roztworu, należy zwiększyć tę objętość w zależności od liczby użytych płytek do oznaczania (np. 5 płytek do oznaczania, 625 μl).
   2. Odpipetować 100 μl roztworu siarczanu miedzi (II) na krawędzi agaru, aby utworzyć zewnętrzną barierę miedzianą. Zaznaczony spód płyty powinien służyć jako wskazówka.
   3. Odpipetować pipetą 25 μl roztworu siarczanu miedzi (II), aby utworzyć barierę w linii środkowej.
      1. Upewnij się, że roztwór siarczanu miedzi (II) nie ma kontaktu z plastrem bakteryjnym. Użyj techniki plamistego, ponieważ smugi mogą wpływać na poruszanie się z powodu wgłębień/zadrapań na agarze.
   4. Pozostaw roztwór miedzi do wyschnięcia na płycie. Okres może się różnić w zależności od warunków panujących na talerzu i w laboratorium. Sprawdzaj wzrokowo suchość co 5 minut po przeniesieniu.
      UWAGA: Roztwór miedzi ma niebieskawy odcień i jest łatwy do zidentyfikowania. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby delikatnie przetrzeć roztwór w pobliżu krawędzi płytki, aby dostrzec suchość.
   5. Odpipetować 20 μl osadu robaka z dna probówki na wolną od bakterii połowę płytki testowej.
      1. Upewnij się, że 10 robaków zostało przeniesionych na płytkę testową. Jeśli przypadkowo dołączono dodatkowe robaki, usuń je, zbierając olejem halowęglowym, aby upewnić się, że na płytkę nie zostaną dodane żadne bakterie. Każdy test powinien mieć stałą liczbę nicieni podczas testu.
         UWAGA: Jeśli podczas testów przenoszonych jest zbyt mało robaków, zwiększenie początkowej wielkości próbki zmniejszy potencjalne straty podczas płukania i przenoszenia.
   6. Usunąć nadmiar M9 z płytki za pomocą chusteczki laboratoryjnej. M9 nie powinien mieć kontaktu z roztworem siarczanu miedzi (II).
      Ostrzeżenie: Upewnij się, że robaki i powierzchnia agaru pozostają nienaruszone podczas wykonywania tego kroku. Jeśli jest używana zbyt ostro, tkanka laboratoryjna może tworzyć wgłębienia na powierzchni agaru płytki i usuwać robaki. Robaki przypadkowo usunięte za pomocą KimWipe należy wyrzucić.
   7. Gdy roztwór M9 zostanie usunięty i wszystkie robaki zaczną tworzyć niepłynne wzorce lokomotoryczne, uruchom stoper testowy.
      1. Optymalnie usunąć roztwór M9 w ciągu minuty. Istotnym parametrem jest identyfikacja lokomocji sinusoidalnej. Robaki lokomote poruszają się inaczej, np. młócąc się, a nie sinusoidalnie, gdy znajdują się w płynie. Uruchom stoper testu, gdy każdy z organizmów doświadczalnych przestanie się młócić.
   8. Sprawdzaj płytki testowe co 30 minut.
      1. W przypadku płytek testowych z plastrami bakteryjnymi należy ocenić dodatnio organizmy, jeśli dotrą do plastra z żywnością w ciągu 4 godzin. W przypadku płytek kontroli ujemnej należy ocenić dodatnio organizmy, które przekroczyły barierę.

Wyniki

Rysunek 1: Wizualna reprezentacja oznaczeń wskazujących umieszczenie roztworu miedzi na spodniej stronie 5-centymetrowej szalki Petriego. Wskazania te służą do zapewnienia, że odcinki płytki zostały odpowiednio zmierzone i służą jako wytyczne podczas przenoszenia łaty bakteryjnej, a następnie roztworu miedzi na powierzchnię agaru.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
M9 Roztwór [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 litra. Autoklaw do sterylizacji przed użyciem.]			Wyprodukowano w laboratorium
Siarczan miedzi	Sigma	Silnik C-1297	Użyj wody, aby odpowiednio zawiesić do stężenia 0,5 M