$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem z Turek et al, Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
1. Obrazowanie wapnia
- Należy stosować transgeniczne szczepy wykazujące ekspresję genetycznie kodowanych czujników wapnia, takie jak HBR16 (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
- Użyj mikroskopu złożonego wyposażonego w epifluorescencję o szerokim polu widzenia. Podłącz wyjście TTL kamery EMCCD do wejścia TTL diody LED, tak aby za każdym razem, gdy kamera nagrywa klatkę, próbka będzie oświetlona. Użyj czasu naświetlania około 5 ms. Użyj wzmocnienia EM w zakresie 50 - 300.
- Określ film seryjny trwający 24 godziny, w którym każdy robak jest obrazowany co 15 - 30 minut, najpierw przez 20 sekund za pomocą DIC, następnie przez 20 sekund za pomocą fluorescencji GFP, aby zarejestrować GCaMP, a następnie wykonaj końcowy obraz sygnału mKate2 w celu kontroli poziomów ekspresji. Używaj szybkości odświeżania 2/s podczas każdej serii.
- Do wizualnej kontroli danych należy użyć mapy w sztucznych kolorach, aby zwiększyć widoczność niewielkich zmian intensywności fluorescencji. Wykreślić dane fluorescencyjne jako ΔF/F, gdzie F jest średnią wartością bazową fluorescencji. Szczegółowy opis analizy danych dotyczących wapnia można znaleźć w literaturze.