Ten protokół jest fragmentem Xu i Chisholm, Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).
1. Laserowe ranienie
UWAGA: Użyj femtosekundowego naświetlania laserem (800 nm), aby wykonać bardziej precyzyjne zranienie.
- Przygotuj płatki agarowe na szklanym szkiełku z roztopionym 2% agarem. Upewnij się, że elektrody są podobne do padów agarowych używanych do obrazowania na żywo C. elegans.
- Przenieś 10 młodych dorosłych robaków na podkładkę agarozową za pomocą wykałaczki do robaków i dodaj 2 μl kropli 12 mM roztworu lewamizolu. Przykryj zwierzęta i płyn szkiełkiem nakrywkowym. Odczekaj 1-2 minuty, aż robaki sparaliżują.
- Umieść szkiełko podstawowe na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem. Przesuń scenę, aby znaleźć robaki i skup się na bocznym przednim lub tylnym naskórku syncytialnym za pomocą obiektywu 100X (NA 1,4-1,46).
- Ustaw moc lasera femtosekundowego na 140 mW (mierzoną przed obiektywem). Używaj lasera femtosekundowego z częstotliwością powtarzania 80 MHz.
UWAGA: Dwa impulsy po 200 ms każdy (oddalone od siebie o 20 ms) wystarczą, aby zranić się w dłonie.
- Skoncentruj się na wierzchołkowej powierzchni komórki naskórka i zranij naskórek. Obserwuj miejscowe przerwanie cytoplazmy (bulgotanie) lub miejscowe blaknięcie dowolnego użytego markera fluorescencyjnego.
UWAGA: Podczas korzystania z lasera femtosekundowego należy przestrzegać odpowiednich procedur bezpieczeństwa lasera. Skany liniowe lub punktowe przy użyciu laserów femtosekundowych, takich jak te w dwóch mikroskopach fotonowych, powinny zapewnić wystarczającą moc do zranienia laserowego.
UWAGA: Chociaż nie mamy bezpośredniego doświadczenia w stosowaniu innych laserów, w zasadzie zranienie powinno być możliwe przy użyciu konwencjonalnych laserów UV (stosowanych w ablacjach komórek C. elegans). Opcjonalnie użyj modułu Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) na wirującym dysku konfokalnym w celu nawinięcia naskórka (N. Pujol, komunikacja osobista).
