Karmienie FITC-dekstranem: metoda ilościowego określania przepuszczalności jelit u C. elegans

Streszczenie

Źródło: Le, T. A. N., et al. Pomiar wpływu bakterii i substancji chemicznych na przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp. (2019).

Ten film przedstawia metodę wizualizacji i pomiaru integralności światła jelita C. elegans poprzez karmienie robaków dekstranem znakowanym FITC. Przykładowy protokół pokazuje test wykonany na robakach 3,3'-diindolilometanu (DIM) i karmionych patogenami.

Protokół

Ten protokół jest fragmentem z Le et al, Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Przygotowanie płytek NGM do badania wpływu substancji chemicznej (DIM) na przepuszczalność jelitową C. elegans karmionych P. aeruginosa
   1. Dodaj 0,5 g peptonu, 0,6 g NaCl, 195 ml wody destylowanej, mieszadło magnetyczne i 6,8 g agaru do szklanej butelki o pojemności 500 ml (agar NGM).
   2. Dodaj 0,5 g peptonu, 0,6 g NaCl, 195 ml wody destylowanej i mieszadło magnetyczne bez agaru do kolejnej szklanej butelki o pojemności 500 ml (bulion NGM).
   3. Autoklawować dwie butelki (z kroków 1.1–1.2), jedną pustą szklaną butelkę o pojemności 100 ml i jedną pustą szklaną butelkę o pojemności 500 ml przez 15 minut w temperaturze 121 °C. Następnie pozostawić butelki zawierające podłoże do ostygnięcia do temperatury 55 °C w łaźni wodnej przez 30 minut. Trzymaj podłoże agarowe w łaźni wodnej i wyjmij butelkę zawierającą bulion (z kroku 1.2) do następnego kroku.
   4. Dodaj dodatki chemiczne do bulionu NGM: 0,4 ml 1 M CaCl₂, 0,4 ml cholesterolu w etanolu (ml), 0,4 ml 1 M_MgSO4 i 10 ml 1 M KPO₄ (wszystkie te składniki muszą być sterylizowane z wyjątkiem cholesterolu w etanolu). Następnie dokładnie wymieszać mieszaninę za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze 55 °C.
   5. Oznacz autoklawowaną pustą szklaną butelkę o pojemności 500 ml dimetylosulfotlenkiem (DMSO), a autoklawowaną pustą szklaną butelkę o pojemności 100 ml za pomocą DIM.
   6. Przenieś 50 ml bulionu NGM do butelki o pojemności 100 ml z oznaczeniem DIM. Dodaj 500 μl bulionu DIM 20 mM do butelki i dobrze wymieszaj.
      UWAGA: DIM jest rozpuszczony w DMSO (zapas 20 mM DIM).
   7. Szybko wyjmij podłoże agarowe NGM z łaźni wodnej, dodaj 50 ml podłoża agarowego NGM do butelki z etykietą DIM i dokładnie wymieszaj.
   8. Umieścić 20 ml podwielokrotności pożywki NGM zawierającej DIM na każdej szalce Petriego o wymiarach 90 mm x 15 mm. Z tego kroku można wykonać około pięciu płytek NGM zawierających DIM.
      UWAGA: Końcowe stężenie DIM w każdej płytce NGM wyniesie 100 μM.
   9. Aby przygotować płytkę NGM zawierającą DMSO, przenieś 150 ml bulionu NGM do butelki o pojemności 500 ml z oznaczeniem DMSO. Dodaj 1,5 ml DMSO do butelki i dobrze wymieszaj.
   10. Dodaj 150 ml podłoża agarowego NGM do butelki z oznaczeniem DMSO i dokładnie wymieszaj.
   11. Umieścić 20 ml podwielokrotności pożywki NGM zawierającej DMSO na każdej szalce Petriego o wymiarach 90 mm x 15 mm. Na tym etapie można wykonać około piętnastu płytek NGM zawierających DMSO.
       UWAGA: Końcowe stężenie DMSO w każdej płytce NGM wyniesie 0,5%.
   12. Zestalić płytki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 godziny i przechowywać je w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
       UWAGA: Protokół może być tutaj wstrzymany.
   13. Wyjąć kulturę E. coli OP50 lub P. aeruginosa PAO1 z lodówki o temperaturze 4 °C i odpowiednio wymieszać kulturę przed rozprowadzeniem na płytkach NGM.
   14. Umieścić 800 μl kultury bakterii E. coli OP50 lub P. aeruginosa PAO1 na każdej świeżej płytce agarowej NGM i pozostawić płytki do wyschnięcia w inkubatorze w temperaturze 20 °C przez noc.
       UWAGA: Protokół może być tutaj wstrzymany. Do trzeciego eksperymentu (ryc. 1) przygotowano dwie płytki NGM zawierające DMSO pokryte żywym E. coli OP50, jedną płytkę NGM zawierającą DMSO pokrytą żywym P. aeruginosa PAO1 i jedną płytkę NGM zawierającą DIM pokrytą żywym P. aeruginosa PAO1.
2. Leczenie bakterii lub karmienia DIM i FITC-dekstranem
   1. Inkubować jaja zsynchronizowane z wiekiem w temperaturze 20 °C przez 64 godziny na płytkach NGM uzupełnionych żywymi bakteriami E. coli OP50 jako pokarmem.
   2. Umyj zsynchronizowane z wiekiem larwy L4 buforem S i przenieś je (ponad 500 robaków) na płytki NGM zawierające różne bakterie i chemikalia. Inkubować je w temperaturze 20 °C przez 48 h.
      UWAGA: Czas zabiegu może wynosić od 24 do 72 godzin, w zależności od użytych bakterii i chemikaliów. Efekt terapeutyczny lub zapobiegawczy DIM można również ocenić poprzez wstępne traktowanie robaków patogenami, a następnie leczenie robaków DIM (efekt terapeutyczny) lub poprzez wstępne traktowanie robaków DIM, a następnie leczenie patogenami (efekt zapobiegawczy).
   3. Aby przygotować płytki uzupełnione dekstranem FITC, należy zmieszać 2 ml inaktywowanego termicznie E. coli OP50 z 4 mg dekstranu FITC. Następnie podzielić 100 μl mieszaniny FITC-dekstranu i E. coli OP50 na dwadzieścia świeżych płytek agarowych NGM (60 mm x 15 mm) i pozostawić płytki do wyschnięcia na 1 godzinę na czystej ławce.
      UWAGA: Końcowe stężenie dekstranu FITC w każdej płytce NGM wyniesie 20 μg/ml.
   4. Przygotować pięć płytek NGM zawierających E. coli OP50 bez dekstranu FITC-dekstran do badania kontrolnego nośnika. W tym celu podzielić 100 μl inaktywowanej termicznie E. coli OP50 na każdą świeżą płytkę agarową NGM (60 mm x 15 mm) i pozostawić płytki do wyschnięcia na 1 godzinę na czystej ławce.
      UWAGA: Dla każdego niezależnego eksperymentu wymagane jest piętnaście płytek NGM z dodatkiem dekstranu FITC i pięć płytek NGM bez dekstranu FITC.
   5. Po 48 godzinach leczenia (od kroku 2.2) przemyć robaki buforem S, przenieść robaki na płytki z dodatkiem dekstranu FITC i płytki NGM bez dekstranu FITC, a następnie inkubować płytki przez noc (14–15 godzin).
      UWAGA: Dla każdej grupy leczonej wymagane jest 5 powtórzeń barwienia FITC-dekstranem (lub podawania w grupie kontrolnej nośnika).
   6. Umyj robaki buforem S i pozwól im wpełznąć do świeżej płytki agarowej NGM przez 1 godz.
      UWAGA: Do każdego niezależnego eksperymentu potrzeba łącznie 20 świeżych płytek NGM. W tym kroku możesz użyć płytki NGM uzupełnionej bez lub z E. coli OP50.
   7. Dodać 50 μl 4% roztworu formaldehydu do każdego dołka czarnej 96-dołkowej płytki o płaskim dnie. Przenieś około 50 robaków z każdej płytki NGM do każdej studzienki w celu pomiarów fluorescencji. Po 1 do 2 minutach dokładnie usuń cały formaldehyd z każdej studzienki i dodaj 100 μl podłoża montażowego, aby pokryć studzienki.
      UWAGA: Roztwór formaldehydu (4%) służy do unieruchamiania i naprawiania robaków. Dla każdej grupy badanej wykorzystuje się 5 dołków (5 powtórzeń) do analizy obrazu.
3. Obrazowanie C. elegans za pomocą systemu obrazowania operetki i oznaczanie przepuszczalności jelit poprzez pomiar wychwytu fluorescencji FITC-dekstranu
   UWAGA:Stereoskopia fluorescencyjna może być używana do analizy obrazu zamiast systemu Operettka.
   1. Przechwytuj obrazy fluorescencyjne i mierz intensywność fluorescencji za pomocą systemu obrazowania Operetta High-Content i analizuj obrazy za pomocą oprogramowania Harmony.
   2. W oprogramowaniu Harmony naciśnij ikonę Otwórz pokrywę, aby otworzyć pokrywę i włożyć płytkę do urządzenia.
   3. Skonfiguruj parametry.
   4. Kliknij przycisk Konfiguruj, wybierz typ płyty (96-dołkowa płyta corning z płaskim dnem) i dodaj kanały (kanały jasnego pola i EGFP).
   5. Dostosuj układ. Przejdź do wyboru Układ, a następnie wybierz Ścieżka i dostosuj parametry (pierwsze zdjęcie na 1 μm, liczba płaszczyzn to 10, odległość to 1 μm).
   6. Wybierz jedną z studzienek zabiegowych i jedno pole przechwytywania i naciśnij Testuj, aby sprawdzić, czy zdjęcia są zadowalające w sekcji Uruchom eksperyment.
   7. Jeśli zdjęcia są zadowalające, wróć do sekcji Konfiguracja i naciśnij ikonę resetowania na końcu ekranu. Następnie należy zaznaczyć wszystkie studnie docelowe i odpowiednią liczbę pól przechwytywania.
   8. Przejdź ponownie do pozycji Uruchom eksperyment i wprowadź nazwę tablicy, a następnie naciśnij Start, aby rozpocząć przetwarzanie.
   9. Aby zmierzyć intensywność fluorescencji, przejdź do sekcji analizy obrazu i wprowadź obraz. Znajdź komórkę, wybierając kanał EGFP i metodę B. Dostosuj wspólny próg do 0,5, obszar do >200 μm², współczynnik podziału do 3,0, indywidualny próg do 0,18 i kontrast do więcej niż 0,18. Następnie oblicz właściwości intensywności i wybierz średnią jako wynik wyjściowy. Naciśnij ikonę Zastosuj, aby zapisać konfigurację.
   10. Przejdź do sekcji Ocena, aby zmierzyć intensywność, uzyskując mapę cieplną i tabelę danych. Ustaw parametr Readout na Cells — Intensity Cell EGFP Average — Average per Well i rozpocznij ocenę.
       UWAGA: Protokół może być tutaj wstrzymany.
   11. Aby wyodrębnić dane z Operetki, kliknij przycisk Ustawienia i wybierz Zarządzanie danymi.
   12. Wybierz pozycję Zapisz archiwum, a następnie otwórz przycisk przeglądania i wybierz plik.
   13. Aby wybrać plik, kliknij mały sygnał + w lewym rogu, a następnie kliknij Pomiar i wybierz Nazwa płyty.
   14. Wybierz plik i kliknij przycisk OK.
   15. Wybierz ścieżkę, aby zapisać plik, klikając sygnał Przeglądaj w aktywnej ścieżce.
   16. Kliknij przycisk Start, aby zapisać plik danych.
       UWAGA: Protokół może być tutaj wstrzymany.
4. Analiza statystyczna fluorescencji FITC-dekstranu C. elegans
   1. Zaimportuj dane i oblicz średnią i odchylenie standardowe (SD) za pomocą oprogramowania statystycznego.
   2. Przeanalizuj istotną różnicę za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnego porównania Tukeya.

Wyniki

Rycina 1: Wpływ DIM na przepuszczalność jelit C. elegans karmionych P. aeruginosa.Obrazy mikroskopowe robaków z (A) E. coli OP50 bez karmienia FITC-dekstranem, (B) E. coli z karmieniem FITC-dekstranem, (C) P. aeruginosa PAO1 z karmieniem FITC...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3,3'-diindolilometan	Sigma	D9568
90×15 mm Szalki Petriego	SPL Life Sciences, Korea Południowa	Numer katalogowy: 10090
Bactor Agar	Becktona Dickinsona	KOD 214010
Roztwór formaldehydu	Sigma	Zobacz materiał F1635
Caenorhabditis elegans N2	Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)		Typ dziki
Cholesterol	Sigma	Zobacz materiał C3045
Płytka testowa, 96-dołkowa z przezroczystym płaskim dnem, nieobrobiona, bez pokrywki polistyren	Corning Incorporated	KOD PRODUKTU: 3631
Dimetylosulfotlenek	Sigma	Zobacz materiał D2650
Escherichia coli OP50	Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)
Izotiocyjanian fluoresceiny - dekstran	Sigma	FD10S
Harmony	PerkinElmer powiedział:		werson 3.5
Siarczan magnezu siedmiowodny	Odczynniki Fisher	Zobacz materiał BP2213-1
Fluoromount wodne medium montażowe	Sigma	Zobacz materiał F4680
Operetka CLS System Analizy Wysokiej Zawartości	PerkinElmer powiedział:	HH16000000
pepton	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Koreańska kolekcja dla kultury typu	KCTC NR 1637
Chlorek sodu	Odczynniki Fisher	Zobacz materiał BP358-1
mikroskop stereoskopowy	Nikon, Japonia	SMZ800N