$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Poniższy protokół jest fragmentem Farboud et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp.(2018).
1. Zgromadzenie RNP
- Zaprojektuj eksperyment z dużym wyprzedzeniem, pozyskując z wyprzedzeniem wszystkie składniki RNA, DNA i białka. W pierwszym przejściu należy wypróbować jedną z kontroli dodatnich wymienionych w tabeli 1 i użyć dostępnych w handlu odczynników opisanych w tabeli materiałów, aby zapewnić wiarygodny projekt doświadczalny i integralność materiałów. Aby uzyskać dodatkowe wskazówki dotyczące planowania nowego eksperymentu z edycją genomu, zobacz artykuły na ten temat.
UWAGA: Po złożeniu zgodnie z opisem w kolejnych krokach, przygotowane wcześniej RNP mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.
- Po wybraniu genu, który ma być celowany, skorzystaj z jednego z bezpłatnych narzędzi online, aby zaprojektować optymalne gRNA. Pamiętaj, aby celować w ekson, jeśli masz nadzieję na wygenerowanie nokautu.
UWAGA: Narzędzia te pomogą zidentyfikować miejsce docelowe z sąsiednią sekwencją PAM S. pyogenes, wynikiem wysokiej jakości i niskim wynikiem poza celem.
- Oczyść białko S. pyogenes Cas9 za pomocą opublikowanych metod lub kup je od komercyjnego dostawcy.
- Przygotuj typowy bufor Cas9 do rozcieńczania RNA, przygotowania RNP i przechowywania białka, który zawiera 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 10% glicerolu i 1 mM TCEP. Zawsze używaj wody wolnej od nukleaz w, które będą używane do ponownego zawieszenia lub rozcieńczenia RNA, aby zapobiec degradacji.
- Wyprodukuj przewodnik RNA (tracrRNA i crRNA lub sgRNA) poprzez transkrypcję in vitro przy użyciu opublikowanych metod lub kup go od firmy zajmującej się syntezą kwasów nukleinowych.
- W przypadku wstawienia genu zsyntetyzuj lub kup matrycę DNA dawcy.
- Porcje białka i RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C i rozmrozić na lodzie bezpośrednio przed użyciem.
UWAGA: Każde zamrożenie i rozmrożenie nieznacznie obniża efektywność. Szczegółowe, ogólnodostępne protokoły oczyszczania Cas9 i transkrypcji sgRNA in vitro są dostępne w innych miejscach.
- Przygotowanie RNP do edycji C. elegans: Zebrać kompleks RNP, dodając następujące odczynniki w celu uzyskania końcowej objętości 20 μL (końcowe stężenia podano w nawiasach): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7,5 (10 μM), KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM), oraz w razie potrzeby matryce naprawcze (0,5 μM ssDNA lub do 350 ng/μL dsDNA).
UWAGA: Skuteczność naprawy za pośrednictwem szablonu DSB za pośrednictwem Cas9 jest proporcjonalna do stężenia konstruktu naprawczego dsDNA; W związku z tym, im wyższe stężenie szablonu naprawczego, tym skuteczniejsza naprawa szablonowa. Wykazano jednak, że wstrzyknięcie mieszanin zawierających więcej niż 350 ng/μl dsDNA zmniejsza żywotność wstrzykniętych robaków. Dlatego najlepiej jest użyć do, ale nie więcej niż 350 ng/μl dsDNA w mieszance, aby zmaksymalizować skuteczność naprawy przy jednoczesnym zminimalizowaniu jej śmiertelności.
- Dodaj wiele crRNA, aby celować w wiele loci jednocześnie, zgodnie z potrzebami w podejściu przesiewowym co-CRISPR/co-conversion. Dodając więcej niż jeden crRNA, dodaj każdy z nich sekwencyjnie do mieszanki głównej.
UWAGA: Ilość każdego crRNA nie musi być taka sama, a nawet podwojenie całkowitego stężenia crRNA w mieszance głównej bez zmiany stężenia Cas9 nie wydaje się kolidować z częstotliwością mutagenezy w określonym locus. Przykłady zostały szczegółowo opisane w Paix et al.
- Mieszać pipetując i obracać roztwór RNP o stężeniu 16 000 x g przez 5 sekund, aby upewnić się, że roztwór zebrał się na dnie probówki.
- Inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez 15 m.
- Odwirować próbkę o masie 16 000 x g przez 1 minutę, aby osadzać wszelkie cząstki, które mogłyby zatkać cienkowierconą igłę do mikroiniekcji. W kolejnych krokach należy użyć supernatantu.
- Przygotowanie C. elegans
1. 1 dzień przed mikroiniekcją: Przygotuj płatki agarozy do mikroiniekcji.
- Przygotuj 3% (w/v) roztwór agarozy w wodzie, dodając agarozę do wody i doprowadzając roztwór do wrzenia na płycie grzejnej lub w kuchence mikrofalowej.
- Ułóż na stole szkiełka podstawowe o wymiarach 24 mm x 50 mm x 1,5 mm i za pomocą szklanej pipety Pasteura umieść na szkiełku małą (~15 μl) kroplę roztworu agarozy. Szybko spłaszcz kroplę agarozy, umieszczając na niej kolejne szkiełko nakrywkowe. Pozwól agarozie zastygnąć, a następnie usuń jedno z szkiełek nakrywkowych.
- Pozostaw na noc szkiełko nakrywkowe pokryte agarozą na blacie do góry do wyschnięcia. Po 24 godzinach przechowuj płatki agarozy w czystym, suchym pojemniku.
UWAGA: Można z nich korzystać w nieskończoność.
2. Wyciągnij igły do mikroiniekcji: używając kapilar ze szkła borokrzemianowego z włóknami (średnica zewnętrzna 1,0 mm i średnica wewnętrzna 0,58 mm), wyciągnij igły w oparciu o Mello i Fire57 oraz inne zasoby. Igły mogą być używane natychmiast lub mogą być przechowywane w czystym, suchym pojemniku, wzmocnionym glinianymi podporami.
3. Do konserwacji robaków przygotuj agar z pożywką dla nicieni (NGM) przelaną na płytki Petriego i nakrapianą bakteriami OP50 (protokoły dotyczące standardowej pielęgnacji C. elegans i przepisy na podłoża wzrostowe znajdują się w Stiernagle).
4. Przygotowanie robaków do mikroiniekcji: 12-24 godziny przed mikroiniekcją, pobierz hermafrodyty w stadium L4 na nową płytkę agarową NG z bakteriami OP50 i inkubuj je przez noc w temperaturze 20 °C. Dla każdej mieszanki celu/iniekcji Cas9 wybierz ~30 robaków na płytkę.
- Dzień mikroiniekcji: Załaduj wyciągniętą igłę do mikroiniekcji supernatantem z roztworem RNP przygotowanym w kroku 1.2.
- Odpipetować supernatant z kroku 1.2.4 do wyciągniętej pipety kapilarnej i napełnić roztwór z pipety kapilarnej do przygotowanej igły do mikroiniekcji (zwykle obciążenie mniejsze niż 0,1 μl).
- Zamontuj załadowaną igłę na aparacie do mikroiniekcji podłączonym do mikromanipulatora. Ustawić ciśnienie w aparacie iniekcyjnym na 250 kPa, a ciśnienie równoważące na 25 kPa.
- Odłam obciążoną końcówkę igły, aby uzyskać ostrą krawędź igły. Umieść kwadratowe szkiełko nakrywkowe o wymiarach 15 mm x 15 mm x 1,5 mm na wierzchu szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 mm x 50 mm x 1,5 mm.
- Pokryj jedną krawędź kwadratowego szkiełka nakrywkowego olejem halocarbon 700.
- Umieścić igłę w oleju, na krawędzi kwadratowego szkiełka nakrywkowego o średnicy 15 mm.
- Używając ręki do prowadzenia stolika mikroskopu i szkiełka nakrywkowego, wyszczotkuj szkiełko w górę i wzdłuż krawędzi igły, jednocześnie wciskając pedał/przycisk wstrzykiwania. Odłamać końcówkę igły do tyłu, zwiększając przepływ płynu na zewnątrz igły. Osiągnij optymalne natężenie przepływu, sprawiając, że mieszanka iniekcyjna przepływa w górę wzdłuż krawędzi igły, tworząc ~1 pęcherzyk/s.
- Potwierdź, że robaki L4 pobrane 12-24 godziny przed mikroiniekcją są w fazie rozwoju młodych dorosłych w dniu iniekcji. Zbierz młode dorosłe robaki na płytkę z agarem NG, na której brakuje bakterii OP50 i pozwól im czołgać się przez 5 minut. Zmniejsza to ilość bakterii przenoszonych do wkładki iniekcyjnej, minimalizując zatykanie się igły.
- Umieść podkładkę do wstrzykiwania agarozy/szkiełko nakrywkowe na lunecie sekcyjnym. Za pomocą wykałaczki połóż mały ślad oleju halowęglowego wzdłuż jednej krawędzi podkładki.
- Używając kilofa pokrytego olejem, zabierz kilka robaków z płytki NG-agar na ścieżkę oleju. Za pomocą cienkiego włoska przymocowanego do pipety, takiej jak wąs do rzęs lub kota, ustaw robaki równolegle, delikatnie wpychając robaki do podkładki agarozowej. Dopóki procedura mikroiniekcji nie jest wygodna, należy montować i wstrzykiwać tylko jednego robaka na raz.
UWAGA: Sucha agaroza odprowadza wilgoć z robaków, powodując ich przyleganie do podkładki. W związku z tym należy działać szybko, ponieważ robaki mogą wyschnąć.
- Po ustawieniu na miejscu i przymocowaniu do podkładki, pokryj robaki kolejnymi kilkoma kroplami oleju halowęglowego (~20 μL) z końcówki kilofa.
- C. elegans Gonad Microinjection with RNPs and Post-injection Care
Protokół mikroiniekcji został zaczerpnięty z Mello i Fire i szczegółowo opisany w innym miejscu.
- Umieść szkiełko nakrywkowe z zamontowanymi robakami na mikroskopie iniekcyjnym. W małym powiększeniu (obiektyw 5X, okular 10X) należy ustawić robaki prostopadle do igły do wstrzykiwań.
- Przełącz się na duże powiększenie (obiektyw 40X, okular 10X), zmień położenie igły w pobliżu ramienia gonady odpowiadającego obszarowi w pobliżu jąder w środkowym i późnym pachytenie.
- Za pomocą mikromanipulatora przysuń igłę do robaka, lekko dociskając naskórek. Następnie jedną ręką dotknij boku stolika mikroskopu, aby przebić igłę przez naskórek. Nacisnąć pedał/przycisk wstrzykiwania i powoli napełnić ramię gonady mieszanką do wstrzykiwań i wyjąć igłę.
- Powtórz ten krok z drugim ramieniem gonady.
- Po wstrzyknięciu robaków usuń szkiełko nakrywkowe/płatek agarozowy i umieść je pod mikroskopem preparacyjnym.
- Za pomocą wyciągniętej pipety kapilarnej usunąć olej z robaków, pipetując na nie bufor M9. Wykonaj ten zabieg, aby uwolnić robaki z agaru.
- Po 10 minutach, gdy robaki będą się miotać w buforze, przenieś je na płytkę NG-agar z bakteriami OP50 za pomocą wyciągniętej pipety kapilarnej. Umieść płytkę w temperaturze 20 °C na 2-3 godziny, aż robaki zregenerują się i zaczną się poruszać.
- Po odzyskaniu należy pojedynczo przenieść robaki na płytki agarowe NG z OP50 i przenieść płytki do inkubatora o temperaturze 25 °C.
- Pozwól robakom, którym wstrzyknięto P 0, rosnąć i składać potomstwo przez 3 dni. Przebadaj potomstwo F1.
- W przypadku korzystania z co-CRISPR lub kokonwersji należy wybrać kandydujące robaki do badań przesiewowych na podstawie tego, czy mają zmutowany fenotyp genu referencyjnego. Pojedynczo przenieść te oznaczone robaki na nowe płytki agarowe NG z OP50 i pozwolić im złożyć potomstwo F2 w temperaturze 20 °C.
UWAGA: Fenotyp wykorzystany do badania przesiewowego lub selekcji co-CRISPR powinien zapewnić wczesne oszacowanie sukcesu edycji Cas9.
- Jeśli fenotyp co-CRISPR nie jest obecny, należy wstrzyknąć plazmid kontroli dodatniej, aby poprawić skuteczność mikroiniekcji.
UWAGA: Na przykład włączenie plazmidu do mieszanki iniekcyjnej, który koduje MYO-2 oznaczony mCherry, pomoże ocenić skuteczność iniekcji. Robaki, którym pomyślnie wstrzyknięto pCFJ90, będą miały potomstwo z fluorescencyjnymi gardłami.
- Zbadaj robaki F1 pod kątem obecności pożądanych zmian. Wybierz matkę F1 do indywidualnego dołka na 96-dołkowej płytce, poddaj ją lizie i zbadaj jej DNA za pomocą amplifikacji PCR specyficznej dla insercji, analizy sekwencji DNA lub testu nukleazy geodezyjnej (CEL-1).
UWAGA: Testy te można przeprowadzić przy użyciu ko-CRISPR/kokonwersji lub innych systemów badań przesiewowych lub selekcji.
