$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem Mariol et al, Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome, J. Vis. Exp.(2013).
1. Naświetlanie promieniowaniem UV i odzyskiwanie transgenicznych robaków
- Napromienianie robakami:
- Wybierz 30-100 fluorescencyjnych transgenicznych zwierząt L4 na osobne płytki hodowlane (15-20 zwierząt na płytce).
- Umieść płytki ze zdjętymi pokrywkami w usieciowaniu UV. Napromieniować robaki w stężeniu 0,012 J/cm2. Należy pamiętać, że szczepy są mniej lub bardziej wrażliwe na promieniowanie UV, a wyniki mogą być różne w zależności od zastosowanego promiennika UV. Można badać zakres dawek w zakresie 0,010-0,015 J/cm2.
- Odzyskiwanie robaków po napromieniowaniu:
- Umieścić płytki z napromieniowanymi robakami na noc w temperaturze 15 °C w celu odzyskania.
- Sprawdź liczbę zwierząt, które żyją. W naszych rękach wskaźnik przeżycia wynoszący około 80-90% jest przystosowany do skutecznego napromieniania.
- Zwierzęta poddane napromienianiu należy hodować w temperaturze 15–25 °C do momentu, gdy potomstwo osiągnie stadium rozwojowe umożliwiające obserwację ekspresji markera jednoczesnego wstrzykiwania.
2. Izolacja zintegrowanych linii transgenicznych
- Selekcja zwierząt F1:
- Pojedyncze 150-200 fluorescencyjnych zwierząt F1 na oddzielnych płytkach hodowlanych. W przypadku linii o dużej przepuszczalności (≥80%) wystarczy 100 zwierząt F1.
- Utrzymywać płytki F1 w temperaturze 15-25 °C do czasu, gdy potomstwo osiągnie odpowiedni etap do obserwacji fluorescencyjnych zwierząt F2.
- Odrzucić wszystkie płytki F1 wykazujące albo i) brak potomstwa, co wskazuje, że zwierzę F1 było bezpłodne lub padło, albo ii) brak lub tylko kilka fluorescencyjnych zwierząt F2, co wskazuje, że zwierzę F1 nie przekazało transgenu w oczekiwanej szybkości. Ten krok jest szybki i stanowi prawdziwą zaletę w porównaniu ze standardowym protokołem, który wymaga oszacowania procentu fluorescencyjnych robaków F2 w celu wybrania płytek F1 wykazujących ≥75% fluorescencyjnego potomstwa (Tabela 1).
- Selekcja zwierząt F2:
- Pojedyncze cztery fluorescencyjne transgeniczne zwierzęta F2 z każdej wybranej płytki F1. W przypadku stosowania transgenów fluorescencyjnych (na przykład mCherry, gfp lub dsRed) należy wybrać robaki F2 o wysokim poziomie fluorescencji, ponieważ może to wskazywać, że zwierzęta te są homozygotyczne pod względem zintegrowanej macierzy. Należy pamiętać, że podczas wybierania zwierząt F2 bardzo ważne jest, aby nie nosić ze sobą jaj ani larw, aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych w następnym kroku.
- Hoduj zwierzęta F2 w temperaturze 15-25 °C.
- Izolacja i walidacja zintegrowanych szczepów transgenicznych:
- Płytki przesiewowe F2 dla 100% fluorescencyjnych transgenicznych robaków F3. Ekran jest dość szybki, ponieważ obecność pojedynczego niefluorescencyjnego robaka wskazuje, że płytkę należy wyrzucić. Zwierzę F2 homozygotyczne pod względem zintegrowanego transgenu da 100% homozygotyczne fluorescencyjne potomstwo.
- Pobrano osiem fluorescencyjnych zwierząt F3 z wybranych płytek, aby potwierdzić 100% dziedziczenie transgenu. Teoretycznie na tym etapie wystarczy wybrać jedno zwierzę. Jednak wybranie ośmiu fluorescencyjnych zwierząt F3 może być konieczne, aby uniknąć wyboru zwierząt niepłodnych lub niezdrowych, ponieważ napromieniowanie może losowo wywołać mutacje, które wpływają na geny ważne dla fizjologii robaków.
- Jeśli to możliwe, należy zachować kilka niezależnych, zintegrowanych szczepów transgenicznych, tj. szczepów odzyskanych od różnych zwierząt F1.
