1. Kalibracja parametrów śledzenia wideo
- Przed podjęciem działań behawioralnych należy ustawić parametry obserwacji i kalibracji w oprogramowaniu do śledzenia wideo (patrz Tabela materiałów).
- Umieścić płytkę studzienkową w komorze rejestracyjnej z co najmniej 1 larwą ryby w osobnej studzience. Użyj płytki i skojarzonych ryb jako reprezentacji, aby ustawić parametry kalibracji.
- W oprogramowaniu do śledzenia wideo kliknij "Plik | Generuj protokół", co otworzy okno dialogowe "kreator tworzenia protokołu". W polu "Liczba lokalizacji" wprowadź liczbę osobników w studni płytki, a następnie kliknij "OK".
- U góry ekranu kliknij "Widok | Pełny ekran", co spowoduje wyświetlenie przez system widoku z kamery nad płytą studzienki.
- Kliknij ikonę "Rysuj obszary", która pojawia się jako trzy wielokolorowe kształty. Po prawej stronie obszaru wyświetlania płytki studzienki wybierz ikonę koła w polu oznaczonym "Obszary".
- Użyj kursora, aby wyznaczyć okrągły obszar śledzenia wideo w lewym górnym rogu płytki studzienki. Wybierz "Znak w prawym górnym rogu", a następnie obrysuj obszar wyświetlania w prawym górnym rogu. Następnie wybierz "Dolny znak", aby dobrze obrysować prawy dolny róg.
UWAGA: Po narysowaniu okrągłego konturu prawdopodobnie konieczne będzie dostosowanie jego położenia. Aby dostosować położenie konturu, kliknij "wybierz", a następnie użyj kursora, aby przesunąć zarysowany obszar. Konspekty można również powielać, klikając "Kopiuj", a następnie "Wklej".
- Po zdefiniowaniu obszarów śledzenia studni w lewym górnym, prawym górnym i prawym dolnym rogu, kliknij "Buduj", aby wyświetlić monit o automatyczne wyznaczenie obszarów wyświetlania pozostałych studni.
- W obszarze oznaczonym "Kalibracja" kliknij "Narysuj skalę". Użyj kursora, aby narysować poziomą linię w poprzek płyty. Po narysowaniu linii pojawi się okno dialogowe oznaczone "Pomiar kalibracji". Wprowadź długość płytki studzienki i kliknij "OK".
- Wyjdź z menedżera rysunków, klikając ikonę "Rysuj obszary".
- Kliknij ikonę "Kafelki". Za pomocą kursora zaznacz wszystkie pola, które pojawiają się na ekranie wyświetlania, tak aby każde pole było zielone.
UWAGA: Ikona kafelków jest wyświetlana jako grupa sześciu pojedynczych małych kwadratów
- "Kliknij Widok| Pełny ekran". Po prawej stronie obszaru wyświetlania płyty kliknij "Bkg" w polu oznaczonym "Próg wykrywalności". Użyj paska regulacji progu, aby ustawić próg wykrywania pikseli. Po wybraniu odpowiedniego progu wykrywania pikseli kliknij "Zastosuj do grupy".
UWAGA: Ten protokół ustawia próg wykrywania na 13 w trybie czarnym dla obserwacji danio pręgowanego i na 110 w trybie przezroczystym dla obserwacji ryb grubogłowych.
- W polu oznaczonym "Próg ruchu" wprowadź żądane parametry śledzenia prędkości ruchu. Po ustawieniu parametrów prędkości kliknij "Zastosuj do grupy".
UWAGA: Ten protokół ustawia małe/duże ruchy na 20 mm/s, a nieaktywne/małe ruchy na 5 mm/s. Selekcje te programują oprogramowanie do śledzenia ruchu larw ryb na trzech różnych poziomach prędkości: nieaktywny (zamarzanie) = <5 mm/s, mały (przelotowy) = 5–20 mm/s i duży (pękający) = >20 mm/s.
- Kliknij "Parametry | Parametry protokołu" z menu rozwijanego. W oknie dialogowym wybierz zakładkę "Czas". Wprowadź czas obserwacji i czas integracji. Po wprowadzeniu parametrów kliknij "OK".
- Aby ustawić czasy jasnego/ciemnego fotoperiodu i intensywność światła dla każdego fotoperiodu, otwórz okno dialogowe ustawień sterownika światła, wybierając "Lekka jazda" z menu rozwijanego "Parametry".
UWAGA: Zobacz film z protokołem, aby uzyskać informacje na temat ustawiania wielu jasnych i ciemnych fotoperiodów.
- Po ustawieniu parametrów śledzenia wideo zapisz protokół obserwacji.
UWAGA: Protokół ten obserwuje zachowanie ryb w okresie 50 minut, który obejmuje 10-minutową fazę aklimatyzacji, po której następują 4 zmieniające się fazy jasne/ciemne, składające się z dwóch 10-minutowych okresów światła i dwóch 10-minutowych okresów ciemności. Czas integracji jest ustawiany tak, aby mierzyć zachowanie dla każdej minuty 50-minutowej próby behawioralnej.
2. Obserwacja zachowań lokomotorycznych i fotomotorycznych larw ryb
- Umieścić płytkę studzienkową zawierającą ryby doświadczalne w komorze zapisu behawioralnego.
- W oprogramowaniu do śledzenia wideo otwórz protokół śledzenia opracowany w następnym kroku.
- W przeglądarce śledzenia wideo sprawdź, czy wszystkie larwy są widoczne na ekranie komputera, czy w każdej studzience znajduje się tylko jedna larwa i czy poszczególne dołki są wyrównane w obszarach obserwacji, które zostały zdefiniowane w krokach 1.1.5 i 1.1.6.
- Kliknij "Eksperyment | Wykonaj".
UWAGA: System poprosi użytkownika o podanie nazwy i lokalizacji w celu zapisania danych obserwacji.
- Po określeniu nazwy i miejsca zapisu danych obserwacyjnych kliknij ikonę "Kilka obrazów na żywo", aby podświetlić wszystkie predefiniowane obszary wyświetlania
UWAGA: Ta ikona znajduje się w górnej części ekranu komputera i pojawia się jako pole podzielone na cztery mniejsze kwadraty. Kliknięcie tej ikony podświetli wszystkie predefiniowane obszary wyświetlania.
- Zamknij panel komory nagrywania i kliknij "Tło | Start" na monitorze komputera.
