Test reakcji ucieczki: metoda badania reakcji larw danio pręgowanego na bodźce dotykowe

Streszczenie

Źródło: Sztal, T. E., et al. Wykorzystanie testów reakcji wywołanych dotykiem i lokomocji do oceny wydajności i funkcji mięśni u danio pręgowanego. J. Vis. Exp.(2016)

Ten film opisuje test reakcji na dotyk, który mierzy reakcję larwy danio pręgowanego na bodźce dotykowe.

Protokół

1. Test reakcji wywołanej dotykiem

1. Przygotowanie 2 zarodków dpf do oznaczania odpowiedzi wywołanej dotykiem
   1. Upewnij się, że pora dnia, w której przeprowadzany jest test, jest spójna między eksperymentami, ponieważ aktywność może się znacznie różnić w ciągu dnia.
      UWAGA: Eksperyment powinien być przeprowadzony w ślepej próbie, a kolejność testów powinna być losowa, aby zminimalizować artefakty eksperymentalne.
   2. Przypisz szczepom ryb liczbę, która jest nieznana osobie przeprowadzającej eksperyment. Następnie za pomocą ogólnodostępnych narzędzi online wygeneruj losową listę, która dyktuje kolejność testów.
   3. Co najmniej godzinę przed badaniem należy usunąć zarodki, wyrywając dziurę w kosmówce i delikatnie rozsuwając kosmówkę za pomocą cienkiej pęsety. Usunąć wszelkie zanieczyszczenia z płytki Petriego przed powrotem do inkubatora w temperaturze 28 °C.
2. Wykonywanie testu odpowiedzi wywołanej dotykiem
   1. Podgrzać do temperatury 28 °C co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem badania.
      UWAGA: Ten stage jest kontrolowany pod względem temperatury i pozostanie na poziomie 28 °C przez cały czas trwania testu. Temperatura będzie miała wpływ na aktywność, dlatego ważne jest, aby utrzymać stałą temperaturę. Jeśli podgrzewany stage nie jest dostępny, temperatura wody powinna być monitorowana, a wszystkie eksperymenty powinny być przeprowadzane w tej samej temperaturze.
   2. Umieść szalkę Petriego wypełnioną pożywką dla zarodków (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM_MgSO4 w wodzie) na oświetlonym stoliku i zamontuj szybką kamerę nad szalką Petriego.
   3. Uruchom oprogramowanie do nagrywania z kamery wideo (takie jak Stream Pix 5, opisane tutaj) i w zakładce "przestrzeń robocza" wybierz 1,000 klatek na sekundę (1,000 fps) jako prędkość przechwytywania, aby zapewnić rejestrowanie szybkiej pływania ryby.
   4. Pracując z jednym zarodkiem na raz, umieść zarodek na środku płytki Petriego, tak aby danio pręgowany był wyraźnie widoczny w polu widzenia.
      UWAGA: Jeśli zarodek odpłynie przed rozpoczęciem eksperymentu, zastąp go innym, ponieważ ponowne schwytanie i ustawienie zarodka może spowodować jego niewrażliwość na bodziec, a powtarzające się reakcje wybuchowe mogą sprzyjać osłabieniu mięśni w niektórych modelach choroby.
   5. Rozpocznij nagrywanie, klikając przycisk "nagrywaj" i dostarcz bodziec mechanosensoryczny do zarodka, delikatnie dotykając go igłą na czubku głowy.
   6. Zatrzymaj nagrywanie, gdy zarodek wypłynie poza pole widzenia lub powróci do spoczynku.
      UWAGA: Przyspieszenie osiąga szczyt w ciągu pierwszych 0,2 sekundy reakcji ucieczki impulsu po bodźcu mechanicznym. W związku z tym należy upewnić się, że co najmniej przez pierwsze 0,2 sekundy od zarejestrowania reakcji ucieczki ryba znajduje się w polu widzenia. Korzystając z oprogramowania Stream Pix 5, dane zostaną automatycznie zapisane jako .avi plik wideo. Można również skorzystać z alternatywnego oprogramowania do przechwytywania wideo, takiego jak Free Video Capture lub Softonic, z których oba są dostępne do bezpłatnego pobrania.
   7. Umieść zarodek z powrotem na nowej szalce Petriego i wybierz inny zarodek do testów. Przeprowadź testy na co najmniej 15 rybach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
90 mm Szalki Petriego	Produkty laboratoryjne Pacyfiku	PT S90001
Pęseta typ 8	Technologia ProSciTech	Zobacz materiał T04-821
inkubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
Szybka kamera	Baumer	Kamera HXC20
Obraz strumieniowy5	NorPix		Krok 1.2.3
Jednostka kontrolująca temperaturę	punkt widzenia
http://www.randomization.com	N/a		Kroki 1.1.2