Wstrzyknięcie morfolino: metoda obniżania docelowej ekspresji genów w celu zbadania funkcji u danio pręgowanego

Abstract

Źródło: Hyde D.R., et al. Elektroporacja in vivo morfolinosów do regenerującej się płetwy ogonowej dorosłego danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2012)

Protokół opisuje celowe obniżenie ekspresji genów u danio pręgowanego poprzez wstrzyknięcie morfoliny w ogon.

Protocol

1. Wstrzyknięcie Morfolino

1. Dzień przed wstrzyknięciem morfolino należy wykonać płytkę do wstrzykiwań (ryc. 1). Upewnij się, że wycięłeś wcięcie na jednym końcu studzienki, co pomaga ustabilizować rybę do procedury mikroiniekcji.
2. Rozcieńczyć morfolino znakowany fluoresceiną do odpowiedniego stężenia (zaleca się rozpoczęcie od 1,2 mM) i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C na 5 minut.
3. Załaduj igłę morfolino (uwaga: w zależności od tego, czy nadziewasz igłę od tyłu, czy od przodu, określi, czy najpierw załadujesz igłę, czy najpierw przetniesz końcówkę).
4. Odetnij końcówkę igły pod kątem.
5. Postępuj zgodnie ze wskazówkami systemu do mikroiniekcji, aby wstrzyknąć około 5 nl pęcherzyków morfoliny na wstrzyknięcie. Większe objętości morfolino mogą zakłócić działanie tkanki.
6. Znieczulić rybę i umieścić na płytce iniekcyjnej. Usuń cały nadmiar płynu i skieruj igłę w odpowiednie miejsce, tylko dystalnie do promienia kostnego (ryc. 2). Używając mikroskopu i aparatu do mikroiniekcji odpowiednich do wstrzykiwań morfolino (patrz Tabela specyficznych odczynników), wstrzyknąć morfolino do płetwy od przodu do tyłu, jak pokazano na rysunku 2. Wstrzyknięcie od tyłu do przodu powoduje zwijanie się tkanki płetwy podczas wstrzyknięcia i jest bardzo trudne.
7. Delikatnie wbić igłę w regeneracyjną tkankę, tylko dystalnie do każdego promienia kostnego (oznaczonego "1" na rysunku 2) i naciskać dystalnie, aż znajdzie się w blastemie (oznaczonym "2" na rysunku 2). Uważaj, aby nie przepchnąć igły przez całą płetwę. Gdy igła jest prawidłowo zlokalizowana, wstrzyknąć morpholino (tj. kliknąć jeden raz). Po 1,2 mM znakowany fluoresceiną roztwór morfolino wydaje się żółto-zielony, nawet w normalnych warunkach oświetleniowych. Przy każdym wstrzyknięciu można uwidocznić żółte "zaciągnięcie" roztworu morfolino, co pomaga zlokalizować wstrzyknięcie w blastemie. Należy wstrzyknąć około 75 nl (10-15 kliknięć) roztworu morfoliny na promień kostny. Przerwa ~ 1 sekunda między kliknięciami. Wstrzykujemy tylko stronę grzbietową, używając brzusznej jako kontroli tylko do elektroporacji.

Results

Rysunek 1. A. Schemat płytki iniekcyjnej, która jest wykonana z agarozy i zawiera małą studzienkę do trzymania ryby podczas mikroiniekcji morfolino.

Rysunek 2. Schemat mikroiniekcji morfolino. A. Umieść rybę w naczyniu z głową ryby w wycięciu wyciętym w studni, co pomoże ryb...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morfolino (Morfolino)	GeneTools, Sp. z o.o		Morfolino powinno być dostosowane do białka, które Cię interesuje
Pompa mikrowtryskowa	Światowe instrumenty precyzyjne, Inc.	Zobacz materiał PV830	Pneumatyczna pompa PicoPump Można zastosować wiele różnych systemów mikroiniekcji
Mikromanipulator	Światowe instrumenty precyzyjne, Inc.	MMJR (Język angielski)	Praworęczny (MMJL dla leworęcznych)
Igły do mikroiniekcji, średnica zewnętrzna 1,0 mm	Światowe instrumenty precyzyjne, Inc.	Numer katalogowy: 1B100F-4	Są to kapilary ze szkła borokrzemianowego, wciągnięte w igłę
Uchwyt na igłę	Światowe instrumenty precyzyjne, Inc.	5430-WSZYSTKIE	Zestaw dysz Pico; Upewnij się, że uszczelka pipety 1.0 mm została włożona
Ściągacz do igieł	Instrument Sutter Co.	Zobacz materiał P-97	Inne ściągacze do mikropipet/igieł również powinny działać
mikroskop	Leica, Nikon, Zeiss	Liczba różni się w zależności od producenta	Dowolny mikroskop stereoskopowy z optyką 20X i możliwością pracy z mikromanipulatorami
2-fenoksyetanol	Sigma-Aldrich	Nr kat. 77861-1L	Znieczulenie; rozcieńczyć w stosunku 1:1000 w wodzie dla ryb do zabiegu, 1:500 do eutanazji