Sekcja serca: metoda obserwacji rozwoju serca danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Singleman C. et al., Sekcja serca u larw, młodocianych i dorosłych danio pręgowanego, Danio rerio. J. Vis. Exp. (2011).

Ten film opisuje technikę izolowania serca od danio pręgowanego na wielu etapach rozwoju w celu zbadania rozwoju, dojrzewania i starzenia się serca.

Protokół

1. Pomiar ryb i sekcja

1. Umieść pojedynczą rybę na szalce Petriego wypełnionej do połowy świeżym PBS i połóż ją na prawym boku.
2. Zmierzyć długość ryby od pyska do podstawy ogona (szypułki ogonowej), nie uwzględniając płetw ogonowych, za pomocą suwmiarki cyfrowej mm (rysunek 1). Jest to standardowa długość (SL).
3. Każdej rybie można przypisać kombinację cyfr/liter, aby umożliwić śledzenie pojedynczej ryby i powstałego w ten sposób wypreparowanego serca w celu późniejszej analizy. Dane, w tym rodzicielski numer stada, wiek w momencie fiksacji, pomiary SL, zostały wprowadzone do arkusza kalkulacyjnego i zorganizowane na podstawie tych etykiet.
4. Przed sekcją należy oznaczyć paski probówki PCR przypisanym numerem śledzenia i napełnić PBT lub innym roztworem odpowiednim do dalszej analizy.
5. Ustaw rybę brzuszną stroną do góry na szalce Petriego, jednocześnie stabilizując ciało za pomocą kleszczy trzymających głowę między oczami a skrzelami (ryc. 1).

Mniejsze ryby (mniejsze niż 12mm SL):

6. a) Za pomocą ostrych kleszczy lub mikro-igły w uchwycie na szpilki, usuń mięśnie piersiowe i płetwy z ciała, aby odsłonić serce. Ciągły ruch kleszczy podczas preparacji może powodować prądy w PBT, które poruszają rybą. Jest to szczególnie problematyczne w przypadku mniejszych ryb, dlatego za pomocą mikroigły można usunąć mięśnie piersiowe i płetwy oraz otworzyć jamę ciała.
7. a) Delikatnie użyj kleszczy, aby wyciągnąć serce z jamy spod przedsionka. Alternatywnie, u niektórych ryb możesz być w stanie usunąć serce, delikatnie wyciągając bulwiaste, a reszta serca podąży za nim. Uważaj na lokalizację przedsionka w przypadku korzystania z tej techniki, ponieważ może on łatwo ulec uszkodzeniu. Jeśli z sercem jest dodatkowa tkanka, jest to w porządku i można ją później usunąć.
8. a) Jeśli ryba zawiera fluorescencyjny marker serca, taki jak Tg(myl7:GFP)^twu34, użyj fluorescencyjnego lunetu do sekcji i sprawdź, czy usunięto serce przez fluorescencję (ryc. 2).
9. a) Po wyjęciu serca z jamy użyj kleszczy do przytrzymania serca i mikroigły, aby usunąć dodatkową tkankę niesercową i wyściółkę nasierdzia z zewnątrz serca.

Większe ryby (większe niż 12mm SL):

6. b) Używając mikronożyczek ze sprężynową rękojeścią, wykonaj trzy nacięcia o głębokości mniejszej niż 1mm: 1- poprzeczne cięcie przez skrzela, 2- poprzeczne cięcie na przedniej części brzucha, 3- strzałkowe cięcie po stronie brzusznej, łączące oba nacięcia (Rysunek 3).
7. b) Za pomocą ostrych kleszczy usuń mięśnie piersiowe i płetwy z ciała, aby otworzyć jamę ciała i odsłonić srebrzystą tkankę osierdzia (ryc. 4A). Usuń tę tkankę osierdzia, a serce stanie się widoczne (ryc. 4B).
8. b) Za pomocą mikronożyczek przeciąć tętnicę połączoną z bulwiastą tętnicą, znajdującą się wyżej od serca. Po przecięciu tej tętnicy umieść końcówki kleszczy pod przedsionkiem, użyj kleszczy, aby zgarnąć serce z jamy. Jeśli z sercem znajduje się dodatkowa tkanka, jest to w porządku i można ją później usunąć.
9. b) Po wyjęciu serca z jamy użyj dwóch kleszczy, aby przytrzymać serce i usunąć dodatkową tkankę lub jedną parę kleszczy do przytrzymania serca i mikroigły, aby usunąć dodatkową, niesercową tkankę. Wyściółka nasierdzia, widoczna przez czarną pigmentację, może zostać usunięta z zewnątrz serca w razie potrzeby, delikatnie zeskrobując tkankę.

Wyniki

Rysunek 1.Trzymaj rybę kleszczami między oczami i skrzelami.

Rysunek 2.Specyficzny dla serca fluorescencyjny marker transgeniczny, taki jak Tg(myl7:GFP)^twu34, pokazany tutaj, może pomóc w wizualizacji serc wyciętych z mniejszych ryb.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kleszcze #55	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 11295-51
Mikronożyczki	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 15005-08
Uchwyt na sworzeń	Narzędzia naukowe	26016-12
Mikroigły	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 10130-10
Szalki Petriego	BD Nauki biologiczne	351029