$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Generowanie pierwotnych mammosfer z linii komórkowych ludzkiego raka piersi
UWAGA: Wykonaj następujące kroki pod sterylnym kapturem hodowlanym.
- Przygotować pożywkę Mammosphere zawierającą DMEM/F12 uzupełnioną o 2 mM L-glutaminę, 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny. Przygotować kompletną pożywkę bezpośrednio przed użyciem, dodając 20 ng/ml rekombinowanego ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF; Sigma), 10 ng/ml rekombinowany ludzki zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF; R&D Systems) oraz 1x suplement B27.
- Odessać pożywkę z kolby zawierającej przylegające komórki MCF-7 lub MDA-MB-231 (lub wybraną linię komórkową raka piersi; 70-80% konfluencji), przemyć dwukrotnie w 1x PBS i trypsynizować komórki.
- Odwirować komórki w temperaturze 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1-5 ml pożywki mammosferowej. Pipetować w górę i w dół, a w razie potrzeby użyć filtra siatkowego o wielkości 40 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Użyj hemocytometru, aby upewnić się, że utworzyła się zawiesina pojedynczej komórki (jeśli nie, użyj igły 25 G, aby strzykawką zawiesinę komórek do 3 razy).
- W razie potrzeby wyizolować podzbiór komórkowy CD44 + CD24- za pomocą FACS przy użyciu przeciwciał monoklonalnych anty-CD24-fikoerytryny (PE) i izotiocyjanianu anty-CD44-fluoresceiny (FITC)9. Alternatywnie, wyizoluj taką populację za pomocą systemu sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) z mikrogranulkami połączonymi anty-CD44 i anty-CD24-biotyną zgodnie z instrukcjami producenta. Przeprowadź selekcję pozytywną przy użyciu kolumn LS i selekcję negatywną przy użyciu kolumn LD i potwierdź fenotypy wszystkich izolowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej.
- Oblicz liczbę żywotnych komórek na ml za pomocą błękitu trypanowego.
nuta: Żywotność komórek oblicza się jako liczbę żywotnych komórek podzieloną przez całkowitą liczbę komórek w siatkach na hemocytometrze. Komórki, które pobierają błękit trypanowy, są uważane za niezdolne do życia. Poniższa procedura służy do dokładnego określenia proporcji żywotnych komórek.
- Przygotować 0,4% roztwór błękitu trypanowego w PBS. Dodać 0,1 ml roztworu podstawowego błękitu trypanowego do 1 ml komórek. Załaduj hemocytometr i zbadaj natychmiast pod mikroskopem w małym powiększeniu. Policz łączną liczbę komórek i liczbę komórek barwiących na niebiesko. Żywe komórki = [1.00 – (Liczba niebieskich komórek ÷ Liczba wszystkich komórek)] × 100.
- Aby obliczyć liczbę żywotnych komórek na ml hodowli, skorzystaj z poniższego wzoru. Należy pamiętać o skorygowaniu współczynnika rozcieńczenia.
Liczba komórek zdolnych do życia × 104 × 1,1 = komórki/ml hodowli
- Ponownie zawiesić wcześniej określoną ilość komórek w 2 ml kompletnej pożywki mammosfery w każdym dołku 6-dołkowej płytki o bardzo niskiej przyczepności. Gęstość wysiewu wynosi zwykle 500-4,000 komórek/cm2 komórki na studzienkę. Opcjonalnie należy użyć 24-dołkowych płytek o niskim natężeniu podczas wysiewu komórek o tej samej gęstości w 0,5 ml pożywki.
nuta: Zalecamy optymalizację gęstości wysiewu i czasu hodowli dla każdej interesującej nas linii komórkowej.
- Inkubuj 6-dołkowe płytki o bardzo niskim stopniu przylegania w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5-10 dni (w zależności od linii komórkowej i wielkości mammosfer) bez naruszania płytek, szczególnie podczas fazy wzrostu pierwszych 5 dni.