Transdukcja w celu znakowania komórek nowotworowych PDX: wprowadzenie markera fluorescencyjnego eksprymującego lentiwirusa do komórki nowotworowej in vitro

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Hanna, C., et al. Oznaczanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi za pomocą identyfikowalnych reporterów do badań nad wzrostem guza i przerzutami. J. Vis. Exp. (2016).

Poniższy film opisuje technikę transdukcji do znakowania (ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta) komórek nowotworowych PDX, która jest używana do wprowadzania do komórki nowotworowej in vitro wirusa lentiwirusa wyrażającego białko zielonej fluorescencji i reportery lucyferazy.

Protokół

1. Transdukcja komórek nowotworowych pochodzących z PDX

Odwirować zdysocjowane komórki nowotworowe w czasie 300 g x 5 min i ponownie zawiesić w 2 ml pożywki mammosferowej. Policz żywe komórki za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego (Ponownie zawiesić strawione komórki w 5 ml buforu do płukania i policzyć zarówno żywotne, jak i nieżywotne komórki przy użyciu wykluczenia błękitu trypanowego. Krótko zmieszać 50 μl komórek i 50 μl błękitu trypanowego i policzyć komórki z wyłączeniem trypan-błękitu za pomocą hemocytometru).
Przygotować 10 ml pożywki mammosfery zawierającej 8 μg/ml polibrenu (2 μl podstawowego polibrenu na ml pożywki).
Określ objętość potrzebną dla 2 x 10⁵ żywotnych komórek nowotworowych. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 2 ml pożywki zawierającej polibren. Płytka 2 x 10⁵ żywotnych komórek nowotworowych na studzienkę w 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej o bardzo niskiej przyczepności.
nuta: Jest to optymalna liczba komórek potrzebna do transdukcji z jednym wektorem lentiwirusowym.
ostrożność!Z cząstkami lentiwirusowymi i wszystkimi materiałami eksploatacyjnymi stosowanymi z cząstkami lentiwirusa należy obchodzić się zgodnie z procedurami instytucjonalnymi dotyczącymi zagrożeń biologicznych związanych z rekombinowanym DNA.
nuta: Transdukcja lentiwirusowa pierwotnych komórek piersi silnie faworyzuje komórki mioepitelialne, co może skutkować słabym znakowaniem komórek luminalnych i selekcją subpopulacji komórek nowotworowych podczas znakowania.
Inkubować wirusa z neuraminidazą o stężeniu 200 mU/ml w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przed transdukcją, aby zwiększyć wiązanie cząstek wirusa z różnymi pierwotnymi subpopulacjami komórek i skorygować to potencjalne odchylenie.
Dodaj cząstki lentiwirusa w temperaturze 10 MOI (2 x 10⁶ TU dla 2 x 10⁵ żywotnych komórek), jeśli komórki zdysocjowane PDX są zubożone z komórek myszy Lin + lub wzbogacone w komórki EpCam +. Dodać cząstki lentiwirusa w temperaturze 30 MOI (6 x 10⁶ TU dla 2 x 10⁵ żywotnych komórek), jeśli używasz niewzbogaconych komórek zdysocjowanych PDX.
nuta: Zwiększony MOI pozwala na wydajną transdukcję nawet w obecności dużych ilości zanieczyszczeń i martwych komórek w surowych ekstraktach. Utrzymuj jedną studzienkę z nieoznakowanymi komórkami, aby służyła jako kontrola żywotności i wydajności transdukcji.
Zawiruj, aby wymieszać wirusa z komórkami. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez okres do 96 godzin. Dodać 500 μl świeżej pożywki mammosfery 24 godziny po transfekcji. Komórki nie przyczepiają się do płytek, nie zasysają pożywki.

2. Ocena skuteczności transdukcji i reimplantacji znakowanych komórek u myszy z obniżoną odpornością

Monitoruj ekspresję markera śladowego (GFP) co 24 godziny za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 10-krotnym powiększeniu.
nuta: Ekspresję GFP można zaobserwować już po 24 godzinach od zakażenia, ale w większości PDX ekspresja GFP jest wyraźnie widoczna po 72 godzinach (ryc. 1).
Oszacuj wydajność transdukcji, oceniając procent komórek GFP+ w całkowitej studzience.
nuta: Ponieważ hodowle zawierają komórki nowotworowe, szczątkowe komórki zrębu i martwe komórki w różnym stopniu, studzienki z zaledwie 10% komórkami GFP+ można wszczepić myszy gospodarzowi.
Przenieść transdukowane komórki z płytek 6-dołkowych do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 1 ml pożywki mammosfery do studzienki, aby zebrać wszystkie pozostawione komórki. Ułóż na lodzie.
Dodać 10 ml HBSS/hepes do transdukowanych komórek i odwirować przy 300 x g przez 5 minut, 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić w 50 μl ekstraktu z macierzy podstawowej (BME) na lodzie.
nuta: Podwielokrotności BME należy rozmrozić na lodzie 1-2 godziny przed użyciem. BME zestala się w temperaturze pokojowej; Trzymaj się lodu przez cały czas.
Załaduj komórki osadzone w BME do strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml, trzymaj na lodzie i przynieś do zakładu dla zwierząt w celu reimplantacji myszom NSG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 1: Śledzenie wydajności transdukcji w zdysocjowanych komórkach PDX. A) Komórki zdysocjowane PDX wzbogacone o ludzkie komórki nabłonkowe (zubożenie Lin+) 24 godziny po transdukcji cząstkami lentiwirusa pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro. B) Komórki zdysocjowane PDX z oddzielnego eksperymentu, bez wzbogacania komórek nabłonkowych, 72 godziny po transdukcji pHAGE-EF1aL-lucyferazy-UBC-GFP-W. ...