Współkultura komórek BC: hodowla komórek raka piersi z fragmentami kości w celu zbadania proliferacji komórek rakowych

Streszczenie

Źródło: Templeton, Z. S., et al. Methods for Kultur Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche. J. Vis. Exp (2015).

Ten film opisuje hodowlę komórek raka piersi przylegających do eksplantatów kości udowej w celu zmierzenia proliferacji i kolonizacji komórek rakowych w systemie modelowym ludzkiej tkanki kostnej.

Protokół

1. Hodowla komórek raka piersi sąsiadujących z fragmentami kości w celu pomiaru proliferacji komórek piersi za pomocą BLI

1. Przed eksperymentem należy przygotować zawiesinę zawierającą 2 x 10⁵ komórek raka piersi/50 μl oraz przygotować czopy wosku kostnego do unieruchomienia fragmentów kości w hodowli. Pokrój końcówkę mikropipety P200 na 3 części i użyj wąskiego końca największego kawałka w formie "foremki do ciastek", aby pokroić małe (~35 mg) kawałki wosku kostnego. Użyj szerokiego końca najmniejszego kawałka, aby wysunąć korki wosku kostnego do szalki Petriego w celu przechowywania.
2. Umieść kawałek wosku kostnego w pozycji godziny 12 każdego dołka i delikatnie dociśnij palcem wskazującym w sterylnej rękawiczce.
3. Odpipetować 50 μl zawiesiny komórkowej zawierającej 1 x 10⁵ komórek raka piersi w DMEM-10% FBS + Pen-Strep w środku każdego dołka 6-dołkowej płytki. (Alternatywnie, komórki nasienne w rozproszonym wzorze, jeśli jest to pożądane.) Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 45 minut, aby ułatwić przyczepienie komórek.
4. Umieść 1 fragment kości na 1 kawałku wosku kostnego dla każdej studzienki eksperymentalnej i delikatnie dociśnij rongeur, aby go zabezpieczyć. Przeprowadzaj eksperymenty w trzech egzemplarzach, tak aby 3 fragmenty kości z danej próbki THR były umieszczane w trzech górnych studzienkach, podczas gdy trzy dolne dołki zawierały wosk kostny tylko jako kontrole.
5. Za pomocą pipety o pojemności 5 ml delikatnie i powoli podaj 5 ml DMEM-10% FBS na bok każdej studzienki, aby uniknąć przemieszczenia komórek piersi lub fragmentów kości. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 20-24 godziny.
6. Aby wykonać obrazowanie bioluminescencyjne (BLI), wyjmij płytkę z inkubatora i dodaj substrat lucyferyny (do osiągnięcia stężenia 300 μg/ml) do każdej studzienki. Zobrazuj płytkę natychmiast na platformie obrazowania IVIS przy użyciu następujących parametrów: przysłona 1, małe binning, czas ekspozycji 1 s, poziom D. Zmierz intensywność sygnału w każdej studzience jako średnie promieniowanie (fotony/sekunda/centymetr kwadratowy/steradian).
7. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby zdefiniować obszary zainteresowania (ROI) w celu ilościowego określenia średniego promieniowania dla wszystkich studni eksperymentalnych i kontrolnych. Eksportuj średnie wartości radiancji do arkusza Excel, aby wykonywać statystyki i generować wykresy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 10569-010	Uzupełnij wszystkie DMEM 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% Pen/Strep
Surowica bydlęca płodu	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 16000-044
Penicylen Streptomycyna	Technologie życiowe	Rozdział 15140-122
D-lucyferyna świetlik, sól potasowa 5 g (30 mg/ml)	Technologie życiowe	L-8220
6 Dobrze traktowany klaster kultur komórkowych z TC	Corning Incorporated	Numer katalogowy: 3516
Friedmana-Pearsona Rongeura	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 16021-14
Wosk kostny	Korporacja Specjalizacji Chirurgicznych	Okręg wyborczy 903
Platforma obrazowania IVIS 50	Suwmiarka Nauki Przyrodnicze/PerkinElmer
Komórki raka piersi MCF-7	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał HTB-22
MDA-MB-231 komórki raka piersi	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał HTB-26

TGL