Współkultura 3D z bezpośrednią interakcją: współhodowla komórek rakowych z monocytami w celu zbadania ich interakcji

Streszczenie

Źródło: Espinoza-Sánchez, et al. Analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME). J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje 3D kokulturę komórek raka piersi z monocytami w celu zbadania ich interakcji w środowisku opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME). Ta metoda pomaga w badaniu określonych cech, takich jak degradacja kolagenu, rekrutacja komórek odpornościowych i inwazja komórek.

Protokół

1. 3D współkultury z bezpośrednią interakcją

1. Oznacz komórki BrC i monocyty różnymi barwnikami fluorescencyjnymi przed hodowlą komórkową, aby umożliwić niezależne sortowanie każdej linii komórkowej po hodowli w celu analizy mRNA i ekspresji białka. Stosuj dostępne w handlu pochodne kumaryny i rodaminy, które swobodnie przechodzą przez błonę komórkową żywych komórek. Ogólny protokół etykietowania jest następujący:
   1. Przygotować monowarstwę komórek BrC będących przedmiotem zainteresowania (2 × 10,⁶ komórek w kolbie hodowlanej o średnicy 25^cm2) i zastąpić wzorcową pożywkę wystarczającą ilością wstępnie ogrzanego roztworu roboczego barwnika fluorescencyjnego (1:2 000 barwnika fluorescencyjnego w standardowej pożywce bazowej bez żadnego dodatku). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku o stężeniu 5% CO_{2 .} Odessać roztwór barwnika i delikatnie spłukać wystarczającą ilością 1x PBS. Odessać PBS i dodać pożywkę wzorcową.
   2. Trypsynizować monowarstwę komórki za pomocą 2 ml roztworu 0,05% trypsyny i 0,48 mM EDTA przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 200 μl FBS, aby zatrzymać trypsynizację i 7 ml odpowiedniej pożywki bez suplementów. Zawiesić komórki przez pipetowanie. Pobrać podwielokrotność 10 μl, aby policzyć komórki w komorze Neubauera. Kontynuuj protokół kohodowli po zliczeniu komórek.
   3. Osadzać komórki w dawce 430 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (wykonaj tę czynność najpierw, ponieważ monocyty rosną w zawiesinie). Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić komórki 3 ml wstępnie podgrzanego roztworu roboczego barwnika fluorescencyjnego (1:2 000 barwnika fluorescencyjnego w standardowej pożywce bazowej bez dodatków). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku o stężeniu 5% CO_{2 .}
   4. Ponownie otocz komórki, wyrzuć roztwór roboczy barwnika i delikatnie ponownie zamieszaj z 5-7 ml 1x PBS. Ponownie zatopić osady, wyrzucić PBS i ponownie zawiesić komórki w 5-7 ml standardowej pożywki. Pobrać podwielokrotność 10 μl zawiesiny komórkowej, aby policzyć komórki w komorze Neubauera. Kontynuuj protokół kohodowli po zliczeniu komórek.
2. Ustaw kokulturę w następujący sposób: rozprowadź wystarczającą ilość ECME na dnie studzienki, aby utworzyć równą warstwę w każdym dołku 4-dołkowego systemu szkiełek komorowych. Płytka 20 μl zawiesiny jednokomórkowej zawierającej 5 ×^10,5 znakowanych komórek BrC na studzienkę.
3. Po 15-20 minutach inkubacji w temperaturze 37 °C dodać zawiesinę 2,5 x 10⁵ znakowanych monocytów w 80 μl pożywki testowej (uzupełnionej 60% ECME).
4. Pozostawić ECME do zestalenia się na 15-20 minut w temperaturze 37 °C.
5. Dodać 1 ml mieszaniny komórek BrC i pożywki do hodowli monocytów w proporcji 1:1.
6. Inkubuj kokultury w temperaturze 37 °C w nawilżonym środowisku o stężeniu 5% CO₂ przez 24 godziny, 48 godzin lub 5 dni, aby śledzić zmiany w różnych punktach czasowych.
7. Degradacja białek ECM w celu odzyskania komórek z hodowli. Odessać i odrzucić pożywkę, dodać 0,5 ml 1x PBS z 0,1% trypsyny i 0,25% EDTA i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C. Po inkubacji dodać 0,5 ml 1x PBS z 10% FBS, aby zneutralizować trypsynę, i ponownie zawiesić komórki przez energiczne pipetowanie, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
8. Osadzać komórki w temperaturze 765 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml 1x PBS z 10% FBS. Powtórz ten krok raz.
9. Zawiesinę komórek należy poddać sortowaniu komórek aktywowanemu fluorescencją (FACS) za pomocą odpowiedniego przyrządu. Upewnij się, że końcowe populacje są czyste w co najmniej 95%).
10. Po posortowaniu umyj komórki sterylnym 1x PBS, granulem (430 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej) i ponownie zawieś w sterylnym 1x PBS. Komórki mogą być przetwarzane zgodnie z określonymi protokołami izolacji RNA lub analizy białek.
11. Powtórz każdy test trzy razy, włączając hodowle 3D każdej pojedynczej linii komórkowej jako kontrole.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
U937	Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC	CRL-1593.2	Linia komórek monocytowych/chłoniak histiocytarny
THP-1	Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC	TIB-202	Linia komórek monocytowych/ostra białaczka monocytowa
MCF-10A	Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC	CRL-10317	Nieprzekształcona linia komórek piersi
MCF-7 (Moduł MCF-7	Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC	Zobacz materiał HTB-22	Linia komórkowa raka piersi
MDA-MB-231	Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC	Zobacz materiał HTB-26	Linia komórkowa raka piersi
RPMI 1640 średni	GIBCO BRL Life Technologies	Numer katalogowy 11875-093
DMEM/F12	GIBCO BRL Life Technologies	Numer katalogowy: 11039-021
Antybiotyk/Antybiotyk	GIBCO BRL Life Technologies	Numer katalogowy: 15240-062	100 μg/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,25 μg/ml fungizonu
Surowica bydlęca płodu	GIBCO BRL Life Technologies	Numer katalogowy: 16000-044
Surowica konia	GIBCO BRL Life Technologies	16050114
0,05% Trypsyna-EDTA 1X	GIBCO BRL Life Technologies	25300-062
PBS 1X (sól fizjologiczna buforowana fosforanami	GIBCO BRL Life Technologies	20012-027
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)	PeproTech	AF-100-15 (1,00 mg)
insulina	SIGMA-ALDRICH	I1882-100MG
Hydrokortyzon	SIGMA-ALDRICH	H088-5G
Toksyna Vibrio cholerae	SIGMA-ALDRICH	Zobacz materiał C8052-1MG
Matrigel	Corning Inc	356237	Mięsak myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), ekstrakt z macierzy zewnątrzkomórkowej, przechowywać w temperaturze -20°C do użycia w temperaturze 4°C
Szkiełko komorowe Lab-Tek z pokrywą (8 dołków)	Nalge Nunc Międzynarodowy	177402

powiedział: powiedział: powiedział: )