Pożywka kondycjonowana narządowo: Generowanie pożywki z pobranych komórek narządów do badań nad rakiem z przerzutami

Streszczenie

Źródło: Piaseczny, M. M., et al. Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Study Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior. J. Vis. Exp.(2016).

Ten film opisuje metodę generowania pożywki kondycjonowanej przez narządy pochodzącej z wątroby myszy. Ten system modelowy może być wykorzystany do identyfikacji i badania rozpuszczalnych czynników pochodzących z narządów oraz ich wpływu na tropizm narządów i przerzutowe zachowanie komórek nowotworowych.

Protokół

1. Generacja mediów kondycjonowanych przez płuca i mózg

1. W sterylnym kapturze do hodowli tkanek odwróć trzykrotnie probówki PBS zawierające płuca lub mózg, aby usunąć resztki krwi z narządów i odessać PBS zawierające krew. Powtarzać ze świeżym, zimnym PBS, aż roztwór stanie się klarowny bez śladów krwi.
2. Płuca i mózgi należy umieścić w oddzielnych szklanych szalkach Petriego o grubości 60 mm2. Używając dwóch sterylnych ostrzy skalpela, zmiel płuca lub mózgi, wielokrotnie krojąc tam iz powrotem, aż fragmenty tkanki osiągną rozmiar około ~ 1 mm3.
3. Określ ilość podłoża potrzebną do ponownego zawieszenia fragmentów tkanek na podstawie obliczonej różnicy masy.
   nuta: Tkanka płucna i mózgowa są normalizowane przez ponowne zawieszenie w stosunku 4:1 pożywka do tkanki (vol/wt).
4. Ponownie zawiesić fragmenty tkanek w odpowiedniej objętości (określonej wcześniej w kroku 1.3) zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle's Medium (DMEM):F12 uzupełnionego 1x skoncentrowanym suplementem mitogenu i penicyliną (50 μg/ml)/streptomycyną (50 μg/ml).
5. Dodaj zawieszone fragmenty płuc lub tkanki mózgowej do jednego dołka 6-dołkowej płytki.
6. Inkubować fragmenty tkanek w pożywce przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po inkubacji zebrać kondycjonowane podłoże dla każdej tkanki i dalej rozcieńczyć, dodając trzy równoważne objętości świeżej pożywki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
7. Odwirować przy 1 000 g w rozcieńczonym, kondycjonowanym podłożu dla każdego narządu w temperaturze 4 °C przez 15 minut w celu usunięcia dużych resztek tkanek. Zebrać supernatant pożywki i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
8. Połącz kondycjonowane pożywki z każdego narządu (tj. płuca z płucem i mózgu z mózgiem) od wielu myszy, aby uwzględnić zmienność między myszami. Podwielokrotność i przechowywać kondycjonowane podłoże w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy 10010-023	Utrzymuj sterylność
Szklane szalki Petriego 60 mm2	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Utrzymuj sterylność
DMEM:F12	Technologie życiowe	21331-020	Przed użyciem ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, zachować sterylność
Penicylina-Streptomycyna (10 000 j./ml)	Technologie życiowe	Rozdział 15140-122	Utrzymuj sterylność
Probówki stożkowe 50 ml	Thermo Scientific (NUNC)	339652	Utrzymuj sterylność
Filtry strzykawkowe 0,22 μm	Sigma-Aldrich	Z359904	Utrzymuj sterylność
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych	Thermo Scientific (NUNC)	140675	Utrzymuj sterylność
Ostrza skalpela	Fisher Naukowy	S95937A	Utrzymuj sterylność