Analiza inwazyjności zPDX: badanie inwazyjnego zachowania przerzutowych komórek rakowych w ksenoprzeszczepach zarodków danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Ren, J. et al. Inwazyjne zachowanie ludzkich komórek raka piersi u embrionalnego danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film opisuje metodę mikroiniekcji do dostarczania komórek raka piersi do przestrzeni okołobiałkowej transgenicznych embrionów danio pręgowanego. Po inkubacji wizualizujemy zarodek pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby obserwować inwazję, rozprzestrzenianie się i przerzuty komórek rakowych.

Protokół

1. Obraz i analiza procesu przerzutowego

1. Zbierz kilka znieczulonych zarodków za pomocą pipety Pasteura z szeroką końcówką i przenieś je na szklane dno styropianowego naczynia.
2. Usuń nadmiar wody i zachowaj ograniczoną ilość wody jajecznej. Manipuluj zarodkiem na miejscu za pomocą narzędzia do pętli do włosów i umieść osłonę na szklance.
3. Używaj odwróconego mikroskopu konfokalnego w połączeniu z zanurzonymi w wodzie lub suchymi obiektywami długodystansowymi. Ustaw zarodek w taki sposób, aby obszar zainteresowania był jak najbliżej celu.
4. Wykonaj obrazowanie natychmiast po znieczuleniu, aby zmniejszyć ryzyko śmierci z powodu parowania cieczy.
   1. Przechwytywanie sygnałów z komórek naczyniowych znakowanych EGFP i komórek nowotworowych znakowanych mCherry w tej samej pozycji na zarodkach, aby zarejestrować wstrzyknięte komórki z naczyniami krwionośnymi poprzez połączenie dwóch kanałów obrazowania.
   2. Dla każdego zarodka danio pręgowanego zbierz dwa różne zestawy obrazów z obszaru głowy i ogona.
5. Określ ilościowo liczbę rozsianych komórek.
   1. W przypadku iniekcji przestrzennych okołowitatelowych należy policzyć liczbę komórek w każdej rybie, które rozprzestrzeniły się z masy komórkowej w kierunku zarodkowego ciała ryby w obrębie głowy i ogona 4,15; obszary te znajdują się poza granicami jamy serca z przodu, na szczycie pęcherza pławnego grzbietowo i poza ujściem układu moczowo-płciowego doogonowo.
   2. W przypadku wstrzyknięcia Doc policz liczbę pojedynczych komórek, które zaatakowały włókna kolagenowe płetwy ogonowej z krążenia (MDA-MB-231) lub liczbę skupisk utworzonych przez komórki łącznie (M2) w ogonowej tkance krwiotwórczej (CHT) każdego danio pręgowanego19.
6. Zbadaj inwazję i przerzuty bardziej szczegółowo za pomocą mikroskopii konfokalnej (wysoce zalecane).
   1. Użyj małego powiększenia (obiektyw 4X), aby zobrazować całe ciało i uzyskać przegląd wzorca rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych.
      UWAGA: Większe powiększenie (obiektywy 20X i 40X) jest odpowiednie do badania angiogenezy wewnątrz- i okołonowotworowej oraz precyzyjnej lokalizacji rozsianych komórek w ciele zarodka.
   2. Użyj lasera 488 nm do skanowania naczyń naczyniowych zarodka danio pręgowanego i lasera 543 nm do skanowania wszczepionych komórek nowotworowych znakowanych czerwoną fluorescencją. Uzyskaj wysokiej jakości obraz, skanując każdy zarodek w ośmiu do dziesięciu krokach. Zeskanuj i uśrednij każdy krok sześć razy.
7. Ostrożnie umieść zarodek z powrotem w wodzie jajowej, jeśli jest to wymagane do dalszych eksperymentów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pipeta Pasteura z szeroką końcówką (0,5-20 μl)	Eppendorf	F276456I
Mikroskop konfokalny	Księga Leica	SP5 STED
Mikroskop stereoskopowy	Księga Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) szczep danio pręgowanego			Dzięki uprzejmości dr Ewy SnaarJagalskiej (Instytut Biologii, Uniwersytet w Lejdzie, Lejda, Holandia)
Naczynie styropianowe ze szklanym dnem	WillCo (Spółka WillCo	GWST-5040
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy	Księga Leica	Czołg M165 FC
Trikaina (kwas 3-aminobenzoesowy)	SigmaAldrich	A-5040

powiedział: )