Dysocjacja mechaniczna: metoda uzyskiwania żywotnych komórek z tkanki

1. Przygotowanie homogenatu tkankowego

1. Wycięte tkanki (złośliwe i normalne tkanki wycięte z sali operacyjnej) są umieszczane w laboratorium patomorfologicznym przez przeszkolony personel w celu natychmiastowego odbioru. Guz, NANT (pobrany jak najdalej od guza) i normalne fragmenty tkanek są rutynowo przetwarzane w ciągu 1 - 3 godzin od wycięcia chirurgicznego w laboratorium BSL2 przy użyciu standardowych procedur bezpieczeństwa biologicznego dla tkanek ludzkich. Schemat blokowy protokołu jest zilustrowany na rysunku 1.
2. Zważ wszystkie fragmenty tkanek (normalne, NANT i guz) i zmierz długość, szerokość i wysokość (długość x szerokość x wysokość). Jest to ważny krok dla późniejszej normalizacji subpopulacji komórek, wyekstrahowanego RNA itp.
   nuta: Zakres wielkości próbki wynosi od 100 do 10 000 mm³ bez tłuszczu, jeśli to możliwe.
3. Odcisk fragmentu guza na szkiełku podstawowym w celu barwienia H&E, aby sprawdzić, czy tkanka jest rzeczywiście częścią guza.
   1. Zrób to, naciskając szklane szkiełko mikroskopowe na fragment guza i delikatnie uciskając palcami przez kilka sekund.
   2. Zamocuj szkiełko izopropanolem na 2 minuty, a następnie przemyj je w wodzie. Przeciwbarwić tkankę przez 30 sekund hematoksyliną Mayera.
   3. Umyj szkiełko w sześciu kąpielach wodnych. Barwienie w floksynie B 2% przez 15 sek.
   4. Umyć w jednej kąpieli wodnej, następnie w czterech kąpielach izopropanolu i zakończyć jedną kąpielą w wodzie.
   5. Inkubować w izopropanolu przez 1 minutę i odcedzić. Klarowny w dwóch kąpielach ksylenu.
   6. Zamontuj za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu. Zbadaj komórkowość guza (ryc. 2).
      nuta: Głównie komórki nowotworowe przyklejają się do odciśniętego szkiełka - komórki zrębowe, limfoidalne lub tłuszczowe rzadko pozostają, pozostawiając przestrzenie między komórkami nowotworowymi (ryc. 2).
4. Umieścić fragment tkanki w małym naczyniu hodowlanym zawierającym 1 ml chemicznie zdefiniowanej, pozbawionej surowicy pożywki z komórek krwiotwórczych (zwanej dalej pożywką) w temperaturze pokojowej i pokroić go w drobną kostkę (~1 - 2 mm²) za pomocą sterylnego skalpela.
5. Przenieś wszystko (fragmenty tkanki + pożywka) do mechanicznej rurki C dysocjatora.
6. Przepłukać szalkę Petriego i skalpel 2 ml pożywki za pomocą pipety Pasteura i dodać ją do probówki C (objętość pożywki do dysocjacji = 3 ml).
7. Użyj programu dysocjatora mechanicznego A.01 dla probówek C (najdelikatniejszy program), aby homogenizować fragmenty tkanek w zawiesinę pojedynczej komórki. Umieść rurkę C w aparacie i uruchom program dwa razy z rzędu (jeden cykl = 25 sekund).
   nuta: Ta procedura homogenizacji została ustalona i zatwierdzona dla ludzkiej tkanki piersi, inne typy nowotworów lub tkanek mogą wymagać użycia innego programu i powinny być najpierw przetestowane.
8. Wyjąć probówkę C z aparatu i zdekantować homogenat bezpośrednio do sitka o wielkości 40 μm umieszczonego na probówce o pojemności 50 ml. Używając tej samej pipety Pasteura, co w kroku 1.6, przenieś płyn pozostały w probówce C do sitka do komórek.
9. Przefiltrowaną ciecz przenieść do probówki o pojemności 15 ml za pomocą końcówki do mikropipet o pojemności 1 ml. Tymczasowo należy zachować sitko do komórek i jego probówkę o pojemności 50 ml.
10. Przepłukać probówkę C dodatkowymi 3 ml pożywki i przenieść ją, ponownie używając tej samej pipety Pasteura, co w kroku 1.6, do sitka do komórek, które nadal jest osadzone na probówce o pojemności 50 ml. Wycisnąć maksymalną ilość pozostałego płynu uwięzionego w niehomogenizowanej tkance do probówki o pojemności 50 ml, delikatnie przesuwając ją po sitku za pomocą czystej pipety Pasteura lub końcówki o pojemności 1 ml, którą następnie wyrzuca się, aby uniknąć zanieczyszczenia eluatu.
11. Umieść sitko do komórek do góry nogami na oryginalnej probówce C i spłucz 3 ml pożywki, aby niehomogenizowana tkanka wpadła z powrotem do probówki C.
12. Przeprowadzić ponowną homogenizację jak w kroku 1.7 przez dwa cykle programu A.01.
13. Przelać ten drugi homogenat przez sitko umieszczone na probówce o pojemności 50 ml, ponownie przepłukać probówkę C 3 ml pożywki (jak w kroku 1.10) i przenieść pipetą Pasteura do sitka komórkowego osadzonego na probówce o pojemności 50 ml, ponownie wyciskając maksymalną ilość płynu z pozostałej tkanki łącznej uwięzionej w sitku do komórek.
14. W tym momencie objętość ~2,5 ml znajduje się w probówce 15 ml i ~9 ml w probówce 50 ml.

2. Oddzielenie supernatantu tkankowego od komórek

1. Odwirować homogenaty w probówkach o pojemności 15 ml i 50 ml przez 15 minut przy 600 x g w temperaturze pokojowej.
2. Zdekantować SN z probówki o pojemności 15 ml do czystej probówki i tymczasowo przechowywać w temperaturze 4 °C. Ten supernatant = guz pierwotny, NANT lub SN w tkance prawidłowej (objętość końcowa 2,5 ml) jest następnie klarowany i podawany przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C do przyszłych analiz (patrz poniżej).
3. Odlać sklarowany osad z probówki o pojemności 50 ml.
4. Delikatnie zawiesić oba granulki komórkowe w końcowej objętości 1 ml pożywki. Krótko mówiąc, najpierw delikatnie rozbij osad komórkowy w obu probówkach (stukając rurką o twardą powierzchnię). Zawiesić luźno komórkowy osad w 50 ml z 500 μl pożywki i przenieść tę zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml w celu ponownego zaparcia drugiej osadki. Powtórz ten krok raz z drugimi 500 μl pożywki, aby uzyskać maksymalny odzysk komórek.
5. Przenieść 10 μl zawiesiny komórek do małej probówki, wymieszać z 10 μl błękitu trypanowego (rozcieńczenie 1:1) i policzyć liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru.
   nuta: W tym momencie część zawiesiny komórkowej może być również analizowana za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny wielkości komórki, ziarnistości i, w razie potrzeby, ograniczonej liczby markerów subpopulacji w celu bardziej precyzyjnej oceny względnego rozmieszczenia komórek w homogenacie przed obszerną analizą lub eksperymentami. Wszystkie analizy metodą cytometrii przepływowej obejmują znakowanie CD45 w celu normalizacji subpopulacji.
6. Granulować komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Komórki z guza, NANT lub normalnej tkanki są teraz gotowe do dalszego oczyszczania lub analizy. Te dodatkowe kroki najlepiej wykonywać w tym samym dniu co zabieg.
   nuta: Do analizy metodą cytometrii przepływowej, ale nie do sortowania komórek, pozostałe krwinki czerwone powinny być poddane lizie po znakowaniu przeciwciałami poprzez dodanie 0,4 ml buforu do lizy czerwonych krwinek do osadu komórkowego, natychmiastowe wirowanie przez 1 sekundę i inkubację przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej (chronionej przed światłem) przed analizą.

3. Klarowanie supernatantu tkankowego

1. Odwirować probówki o pojemności 1,5 ml z tkanką SN o stężeniu 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
2. Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie dotykając ani nie naruszając osadu. Przenieść do czystej probówki (lub probówek) w zależności od pożądanej liczby i objętości podwielokrotności.
3. Przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

Rysunek 1: Schemat blokowy protokołu.Przedstawiono naszą procedurę przetwarzania świeżych tkanek ludzkich oraz niektóre podejścia analityczne, które można następnie wykorzystać do oceny limfocytów naciekających tkanki ludzkie

Rycina 2: Wybarwiony H&E obraz odcisku tkanki guza piersi.Ten odcisk, pobrany ze świeżego fragmentu tkanki guza piersi, pokazuje obecność komórek nowotworowych, a otwarte przestrzenie odzwierciedlają obszary, które nie zostały przeniesione.