1. Przygotowanie 3% agarozy 2-hydroksyetylowej
- Do czystej, suchej szklanej butelki o pojemności 100 ml dodaj 0,9 g 2-hydroksyetyloagarozy (Agaroza VII), a następnie 30 ml wody destylowanej.
- Podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej przez 15 sekund i delikatnie zamieszaj. Powtórz ten krok jeszcze co najmniej trzy razy, aż proszek agarozy całkowicie się rozpuści.
- Butelkę z roztworem należy sterylizować w autoklawie przez 15 minut.
- Odczekać, aż roztwór agarozy ostygnie do temperatury pokojowej przed dalszym użyciem. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Przygotowanie dolnej warstwy: 0,6% żelu agarozowego
- W inkubatorze o temperaturze 37 °C należy wstępnie rozgrzać kilka pipet o pojemności 5 ml i 10 ml, aby zapobiec zastyganiu agarozy w pipecie podczas obsługi.
- Częściowo poluzuj pokrywkę butelki i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przygotowany 3% roztwór 2-hydroksyetyloagarozy przez 15 sekund. Następnie delikatnie mieszaj roztwór i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez kolejne 15 sek.
ostrożność: Zachowaj ostrożność podczas wirowania roztworu agarozy, ponieważ roztwór unosi się pod wpływem powietrza i może się rozlać.
- Jeśli w butelce znajdują się resztki stałego żelu, podgrzewaj w kuchence mikrofalowej jeszcze przez kilka sekund.
- Przechowywać butelkę zawierającą roztwór agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C podczas następnych czynności, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu się roztworu agarozy.
- Ciepłe podłoże MCF10DCIS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
nuta: MCF10DCIS pożywka składa się z DMEM/F12, 5% surowicy końskiej, 5% penicyliny streptomycyny.
- Przenieś 3 ml 3% roztworu agarozy za pomocą wstępnie podgrzanych pipet do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Natychmiast dodaj 12 ml ciepłej pożywki MCF10DCIS i delikatnie odwróć stożkową rurkę, aby wymieszać agarozę z podłożem. Staraj się nie tworzyć żadnych pęcherzyków, ponieważ będzie to przeszkadzać w późniejszym liczeniu kolonii.
- Delikatnie dodać 2 ml tej mieszaniny do każdego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej, nie tworząc żadnych pęcherzyków powietrza.
- Inkubować 6-dołkową płytkę hodowlaną poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, aby mieszanina mogła się zestalić.
- Po zestaleniu się mieszaniny umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 30 minut. Dolna warstwa jest teraz gotowa do użycia.
3. Przygotowanie warstwy zawierającej komórkę: 0,3% żel agarozowy
- Trypsynizować MCF10DCIS komórki i rozcieńczyć je do stężenia komórek 4 x 104 / ml.
- Pobrać 2 ml 3% agarozy za pomocą wstępnie podgrzanych pipet i przenieść do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Natychmiast dodaj 8 ml pożywki MCF10DCIS do stożkowej probówki i delikatnie odwróć, aby wymieszać agarozę z podłożem. Unikaj tworzenia się pęcherzyków.
- Pobrać 2 ml komórek MCF10DCIS (4 x 10 4 /ml) i potraktować BB-CLA (0 μM (DMSO) lub 1 μM).
- W rozcieńczeniu 1:1 wymieszać komórki z 0,6% agarozą.
- Pobrać 1 ml mieszaniny komórka i agaroza i delikatnie dodać na dolną warstwę 6-dołkowej płytki hodowlanej (2 x 104 komórki/ml).
- Umieścić 6-dołkową płytkę hodowlaną poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C na co najmniej 15 minut, aby umożliwić zestalenie się wierzchniej warstwy.
- Po zestaleniu się mieszaniny umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na tydzień przed dodaniem warstwy zasilającej.
4. Przygotowanie warstwy zasilającej: 0,3% żel agarozowy
- Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej gotowy 3% roztwór 2-hydroksyetyloagarozy przez 15 sekund, delikatnie obracaj roztwór i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez kolejne 15 sekund.
- Zrównoważyć butelkę z roztworem agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C.
- Ogrzej podłoże MCF10DCIS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Wymieszać 1 ml 3% roztworu agarozy z 9 ml ciepłej pożywki MCF10DCIS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i delikatnie odwrócić, aby wymieszać agarozę z pożywką. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.
- Mieszaninę należy poddać działaniu BB-CLA (0 μM (DMSO) lub 1 μM).
- Delikatnie dodać 1 ml tej mieszaniny (bez tworzenia pęcherzyków) do każdego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej dolną i miękką warstwę.
- Umieścić 6-dołkową płytkę do hodowli poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C na co najmniej 15 minut, aby mieszanina mogła się zestalić.
- Po zestaleniu się warstwy zasilającej umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
- Powtarzaj tę procedurę karmienia co tydzień, nakładając 1 ml 0,3% roztworu agarozy/pożywki/roztworu do leczenia na istniejącą warstwę zasilającą, aby uzupełnić komórki nową pożywką, aż do zaobserwowania tworzenia kolonii.
nuta: Agar w warstwach miękkich i zasilających jest bardzo miękki, dlatego dodane składniki odżywcze z warstwy zasilającej łatwo dyfundują do warstwy zawierającej komórki, aby dotrzeć do komórek.