Wstrzyknięcie żyły ogonowej: metoda podawania komórek rakowych do badań przerzutowych w modelu mysim

Streszczenie

Źródło: Warren et al., Połączone wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film opisuje technikę wstrzykiwania oznaczonych komórek rakowych za pomocą iniekcji żyły ogonowej do modelu mysiego. Ponadto monitorujemy powstawanie i wzrost przerzutów raka piersi za pomocą obrazowania żywych zwierząt w czasie rzeczywistym.

Protokół

1. Iniekcja do żyły ogonowej oznaczonych komórek rakowych

UWAGA: Krok 1.2.4 został zoptymalizowany pod kątem komórek 4T1 rosnących u syngenicznych myszy BALB/c. Jeśli stosowane są inne linie komórek rakowych i szczepy myszy, należy najpierw zoptymalizować liczbę wstrzykiwanych komórek i długość testu.

1. Rozwiń linie komórkowe 4T1 wygenerowane w kroku 2 na dwóch 15-centymetrowych szalkach w kompletnych pożywkach wzrostowych, tak aby nadmiar komórek był dostępny w dniu wstrzyknięcia.
2. Przygotuj komórki do wstrzyknięcia żyły ogonowej w następujący sposób:
   1. Odessać pożywkę i przepłukać płytki komórkowe 1x PBS.
   2. Trypsynizuj komórki 5 ml trypsyny na 15 cm płytkę przez 2-5 minut (komórki powinny swobodnie spłukiwać dno studzienki). Przenieś wszystkie komórki do stożkowej rurki. Umyj pozostałe komórki z naczynia do hodowli tkankowej wystarczającą ilością kompletnego podłoża wzrostowego, aby ugasić trypsynę i dodaj popłuczynę do tej samej stożkowej probówki.
   3. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek, aby określić całkowitą liczbę komórek.
   4. Odwirować komórki przy stężeniu 122 x g przez 3 minuty, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1x PBS w żądanym stężeniu. W tym przypadku każdej myszy wstrzykuje się 2,5 x 10⁴ komórki w 100 μl PBS, a więc komórki ponownie zawieszone w ilości 2,5 x 10⁵ komórek/ml. Zawiesiny komórek należy przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia.
      UWAGA: ważne jest, aby ograniczyć czas między trypsynizacją komórek a wstrzyknięciem żyły ogonowej do około 1 godziny.
3. Wstrzyknąć komórki 4T1 z kroku 1.2.5 myszom przez boczną żyłę ogonową w następujący sposób:
   1. Pracując w kapturze w pomieszczeniu dla zwierząt, delikatnie, ale dokładnie wymieszaj komórki, odwracając probówkę lub używając strzykawki o pojemności 1 ml, aby upewnić się, że są one równomiernie zawieszone. Zawsze upewnij się, że komórki są ponownie zawieszone przed załadowaniem strzykawki.
   2. Załadować strzykawkę Luer-lock o pojemności 1 ml z zawiesiną komórek i usunąć nadmiar pęcherzyków powietrza. Umieść igłę o średnicy 1/2 cala o rozmiarze 30 na strzykawce skosem do góry i usuń pęcherzyki powietrza.
   3. Delikatnie umieść mysz w uchwycie dla gryzoni.
   4. Boczne żyły ogonowe powinny być widoczne i rozszerzone. Jeśli nie, delikatnie uszczypnij podstawę ogona i zanurz ogon w ciepłej wodzie z kranu, aby rozszerzyć żyły.
      nuta: Rozszerzenie żył można również osiągnąć, umieszczając klatkę myszy pod lampą grzewczą i/lub na poduszce grzewczej.
   5. Użyj chusteczki nasączonej alkoholem, aby wyczyścić ogon. Wprowadzić igłę do żyły ogonowej, skośnie do góry i wstrzyknąć 100 μl zawiesiny komórek.
      nuta: Jeśli igła jest prawidłowo wprowadzona do żyły, powinna łatwo przesuwać się lekko do przodu i do tyłu, a przy naciskaniu tłoka nie powinno być oporu. Udane wstrzyknięcia powinny również spowodować "uderzenie", w którym niebieski kolor żyły zmienia kolor na biały na kilka sekund po wstrzyknięciu.
4. Powoli wyjąć igłę i za pomocą jałowej gazy uciskać miejsce wstrzyknięcia, aby zatamować krwawienie.
5. Umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj przez 15 minut, aby zapewnić pełne wyzdrowienie. Myszy należy sprawdzać pod kątem oznak bólu lub niepokoju 3 razy w tygodniu.
6. Monitoruj myszy pod kątem tworzenia i wzrostu przerzutów przez 3-6 tygodni (w zależności od linii komórkowej i szczepu myszy) za pomocą urządzenia do obrazowania żywych zwierząt in vivo (patrz kroki 1.5 i 1.6).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2,5% trypsyna	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 15090-046	Trypsyna do hodowli tkankowej
Chusteczki nasączone alkoholem			Do sterolizacji miejsca wstrzyknięcia przed wkłuciem żyły ogonowej
Myszy BALB/C (samica, 6 tygodni)	Taconic (Taconic)	BALB-F	Do kolonizacji przerzutów do żyły ogonowej i testów obciążenia
Dulbecco&39; s sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Himedia powiedział:	Zobacz materiał TS1006
Edta	Firma VWR	Numer katalogowy: 97061-406	Służy do rozcieńczania trypsyny do hodowli tkankowej
FBS w 100% z USA	Firma VWR	Numer katalogowy: 97068-085	Składnik kompletnych pożywek wzrostowych
L-glutamina	Gibco (firma Gibco)	25030-081	Składnik kompletnych pożywek wzrostowych
Komórki raka piersi myszy, 4T1	Instytut Onkologii Karmanos	Aslakson, CJ i wsp., 1992	Linia komórek kance≥u piersi z przerzutami myszy
Penicylina Streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	Rozdział 15140-122	Składnik kompletnych pożywek wzrostowych