Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Leczenie bleomycyną
- Zaplanuj wstrzyknięcie myszom dotchawczo bleomycyny na 14 dni przed wszczepieniem komórek nowotworowych.
- Rozmrozić bulion z bleomycyny na lodzie 2 godziny przed wstrzyknięciem.
- Po rozmrożeniu rozcieńczyć bleomycynę do pożądanego stężenia roboczego (0,02 U/50 μL lub 0,005 U/50 μL) i przechowywać na lodzie.
nuta: Stężenie bleomycyny zależy od szczepu myszy użytego do eksperymentów (Tabela 1). Należy zwiększyć dawkę bleomycyny u myszy w celu ustalenia optymalnej dawki.
- Przygotuj znieczulenie, rozcieńczając ketaminę i ksylazynę do końcowego stężenia odpowiednio 10 mg/ml i 1 mg/ml, Używając strzykawki 1 ml i igły 27 G, znieczul każdą mysz poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu ketaminy/ksylazyny odpowiednio w ilości 100/10 mg/kg.
- Monitoruj oddech myszy i zastosuj szczypanie palców u stóp. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, gdy mysz nie reaguje na szczypanie palca. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
- Umieść 1 mysz na raz na platformie intubacyjnej, zawieszając jej przednie zęby tyłem o platformę.
- Oświetl górną część klatki piersiowej za pomocą oświetlacza światłowodowego, aby pomóc w wizualizacji tchawicy. Otwórz usta myszy i delikatnie wyciągnij język sterylnymi płaskimi kleszczami.
- Używaj cewnika dożylnego bez igły, aby uniknąć zablokowania oddychania. Umieść cewnik nad białym światłem emitowanym przez otwór tchawicy.
- Wprowadzić cewnik do tchawicy, aż górna część cewnika dotrze do przednich zębów. Potwierdź prawidłowe umieszczenie cewnika w tchawicy, wizualizując białe światło świecące przez otwór cewnika w jamie ustnej.
- Za pomocą pipety dozować 50 μl bleomycyny lub nośnika (PBS) bezpośrednio do cewnika, aby upewnić się, że cała objętość została wdychana. Wykonaj ten krok w sterylnych warunkach.
- Jeśli cewnik zostanie prawidłowo wprowadzony, mysz natychmiast wdycha zawartość cewnika. Odczekaj kilka sekund, aż cała objętość przesunie się w dół cewnika. Następnie wyjmij cewnik z tchawicy i wylej do 10% roztworu wybielacza.
nuta: Średni czas wykonywania kroków 1,7-1,11 przez jedną mysz wynosi około 5 minut.
- Jeśli mysz nie wdycha płynu, uważnie monitoruj oddech i dostosuj położenie cewnika. Jeśli mysz przestanie oddychać, natychmiast wyjmij cewnik i pozwól myszy wznowić normalne oddychanie przed ponownym włożeniem cewnika.
- Umieść wstrzykniętą mysz na zatwierdzonej przez IACUC poduszce grzewczej na plecach na płaskiej powierzchni w celu odzyskania sprawności. Cała procedura zajmie 10 minut na mysz. Nie należy zwracać zwierzęcia, które zostało poddane wstrzyknięciu, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie zostanie w pełni wyleczone.
- Umieść kartę "Niebezpieczna substancja chemiczna w użyciu" na klatce na 24 godziny.
2. Wszczepienie linii komórkowych gruczolakoraka płuc
UWAGA: Wykonaj wszczepienie komórek 14 dni po wstrzyknięciu bleomycyny (krok 1.1)
- Pozostawić komórki do wzrostu w kolbach o długości 75 cm2 bez przeszkód przez 3 dni przed dniem wstrzyknięcia za pomocą odpowiednich pożywek, jak podano w kroku 1.3.
nuta: Powinny one zlewać się w 80% w dniu wstrzyknięcia (co odpowiada 2-3 x 10,6 w każdej kolbie w zależności od linii komórkowej).
- Umyć komórki rosnące na75 cm 2 kolbach z 5 ml PBS w temperaturze pokojowej.
- Odessać PBS i dodać 1,5 ml trypsyny do komórek i inkubować komórki w temperaturze 37 °C, aż komórki się oderwą (zwykle 2-5 min).
nuta: Zalecamy sprawdzanie co 2 minuty pod kątem oderwania komórek od plastiku poprzez prostą wizualizację dna kolby lub pod mikroskopem świetlnym. Nie należy przekraczać 5 minut inkubacji z trypsyną.
- Zneutralizuj trypsynę, dodając 4 ml pożywki zawierającej 10% FBS (ta sama pożywka co w kroku 2.1). Zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować ją przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
- Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml PBS w celu przepłukania komórek. Odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej do osadzania komórek. Powtórz to 1 raz.
- Zassać PBS i ponownie zawiesić osad w 1,5 ml PBS na kolbę.
- Wymieszaj 50 μl mieszaniny komórek z 50 μl błękitu trypanowego i policz komórki za pomocą komory licznika komórek/hemocytometru.
- Przygotować zawiesinę komórkową, rozcieńczając komórki w PBS, aby wstrzyknąć 1 x 105 komórek (lub inną wskazaną ilość) w 50 μl na mysz. Przed wstrzyknięciem należy przechowywać komórki na lodzie.
nuta: Należy przygotować co najmniej dwa razy więcej komórek do wstrzyknięcia, aby uniknąć wyczerpania zawiesiny komórek.
- Przygotować znieczulenie, rozcieńczając ketaminę i ksylazynę do końcowego stężenia odpowiednio 10 mg/ml i 1 mg/ml, Używając strzykawki 1 ml i igły 27 G, znieczulić każdą mysz, wstrzykując dootrzewnowo roztwór ketaminy/ksylazyny odpowiednio w dawkach 100/10 mg/kg.
- Monitoruj oddech myszy i zastosuj szczypanie palców u stóp. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, gdy mysz nie reaguje na szczypanie palca. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
- Umieść 1 mysz na raz na platformie intubacyjnej, zawieszając jej przednie zęby tyłem o platformę.
- Oświetl górną część klatki piersiowej za pomocą oświetlacza światłowodowego, aby pomóc w wizualizacji tchawicy.
- Delikatnie zawieś komórki za pomocą pipety p200, aby upewnić się, że nie tworzą grudek. Otwórz usta myszy i delikatnie wyciągnij język sterylnymi płaskimi kleszczami.
- Użyj cewnika dożylnego z usuniętą igłą, aby uniknąć zablokowania oddychania. Umieść cewnik nad białym światłem emitowanym przez otwór tchawicy.
- Wprowadzić cewnik do tchawicy, aż górna część cewnika dotrze do przednich zębów. Potwierdź prawidłowe umieszczenie cewnika w tchawicy, wizualizując białe światło świecące przez otwór cewnika w jamie ustnej.
- Za pomocą pipety dozuj 50 μl komórek bezpośrednio do cewnika, aby upewnić się, że cała objętość została wdychana. Wykonaj ten krok w sterylnych warunkach.
nuta: Jeśli cewnik zostanie prawidłowo wprowadzony, mysz natychmiast wdycha zawartość cewnika.
- Odczekaj kilka sekund, aż cała objętość przesunie się w dół cewnika, a następnie wyjmij cewnik z tchawicy i wlej do 10% roztworu wybielacza.
- Jeśli mysz nie wdycha płynu, uważnie monitoruj oddech i wyreguluj położenie cewnika. Jeśli mysz przestanie oddychać, natychmiast wyjmij cewnik i pozwól myszy wznowić normalne oddychanie przed ponownym włożeniem cewnika.
nuta: Średni czas wykonywania kroków 2.11-2.18 na mysz wynosi około 5 minut.
- Umieść mysz, której wstrzyknięto tabletkę, na poduszce grzewczej zatwierdzonej przez IACUC na plecach na płaskiej powierzchni w celu odzyskania sprawności.
nuta: Cała procedura zajmie 10 minut na mysz. Nie należy zwracać zwierzęcia, które zostało poddane wstrzyknięciu, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie zostanie w pełni wyleczone.
- Ogol cały obszar żeber, zarówno brzusznie, jak i grzbietowo u B6129SF1/J oraz innych odmian myszy o ciemnych włosach, używając golarki elektrycznej przed obrazowaniem.
- 2-3 minuty po wstrzyknięciu komórki wstrzyknąć 100 μl lucyferyny retroorbitalnie (15 mg / ml) za pomocą igły insulinowej. Zmieniaj oko używane do wstrzykiwań podczas każdej sesji obrazowania.
- Po co najmniej 2 minutach umieść do 5 myszy w zwierzęcym obrazie bioluminescencyjnym w pozycji leżącej grzbietowej i uzyskaj obraz brzuszny za pomocą ustawień luminescencji .
- Pod panelem sterowania dostosuj ustawienia rozdzielczości i czułości, aby zmierzyć luminescencję danej linii komórkowej. W przypadku większości zastosowań zacznij od 3 minut (lub "Auto" w przypadku nasycenia), binning=Średni (4), F/Stop=1, Pole widzenia=D, Wysokość obiektu=1,50,
nuta: Jeśli wstrzyknięcie się powiedzie, sygnał luminescencyjny jest wykrywany w górnej części klatki piersiowej, w jednym płucu lub w obu płucach.
- Przełóż myszy do pozycji leżącej mostka i uzyskaj obraz grzbietowy, jak powyżej.
nuta: Jeśli wstrzyknięcie komórek nie zostanie wykonane prawidłowo, komórki mogą gromadzić się przy wejściu do tchawicy lub w szyi.
- Ketoprofen należy wstrzykiwać dootrzewnowo w dawce 5 mg/kg mc. w celu złagodzenia bólu.
- Przenieś myszy z powrotem do klatki i umieść na niej kartę "BSL-2 Agent in Use".
- Monitoruj myszy pod kątem niewydolności oddechowej natychmiast po intubacji, a następnie co 15 minut, aż myszy obudzą się ze znieczulenia. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej świadomości, aby utrzymać leżący mostek.
- Badaj myszy 24 godziny po intubacji i trzy razy w tygodniu pod kątem jakichkolwiek oznak zachorowalności.
- Zapisuj w dzienniku datę zabiegu, dane identyfikacyjne zwierzęcia, rodzaj zabiegu, rodzaj znieczulenia oraz obserwacje i czas monitorowania pooperacyjnego.
- Monitoruj myszy pod kątem utraty wagi, niewydolności oddechowej, nieprawidłowości behawioralnych i oceny kondycji ciała <2 (segmentacja widocznego kręgosłupa/grzbietowych kości miednicy jest wyczuwalna) co dwa tygodnie po inokulacji bleomycyny.
nuta: Myszy z guzami płuc mogą wykazywać podrażnienie dróg oddechowych, utratę masy ciała, kacheksję i/lub śmierć.
- Eutanazja myszy z niewydolnością oddechową lub myszy, które doświadczyły 15% utraty masy ciała przez dwutlenek węgla lub ketaminę/ksylazynę, a następnie zwichnięcie szyjki macicy w przypadku pobierania tkanek. Potwierdź eutanazję, przeprowadzając badanie palpacyjne pod kątem aktywności oddechowej.
3. Monitorowanie wzrostu guza za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego
- Powtórz obrazowanie myszy w 3. dniu po wszczepieniu, a następnie co tydzień.
- Znieczulenie myszy należy wstrzyknąć ketaminę/ksylazynę (zgodnie z opisem w krokach 2.4-2.5) lub wziewny izofluran (2%). Monitoruj oddech myszy i zastosuj szczypanie palca u nogi, aby potwierdzić prawidłowe znieczulenie. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
- Przed obrazowaniem należy ogolić cały obszar żeber, zarówno brzusznie, jak i grzbietowo u B6129SF1/J i innych odmian myszy o ciemnych włosach, za pomocą golarki elektrycznej.
- Gdy myszy znajdą się pod narkozą, wstrzyknij 100 μl lucyferyny retroorbitalnie (15 mg / ml) za pomocą igły insulinowej. Poczekaj 2 min. Zmieniaj oko używane do wstrzykiwań podczas każdej sesji obrazowania.
- Umieść myszy w imagerze i uzyskaj obrazy grzbietowe i brzuszne zgodnie z opisem w krokach 2.22-2.24.
- Po obrazowaniu umieść myszy z powrotem w klatce, na ich plecach na płaskiej powierzchni w celu odzyskania zdrowia.
nuta: Cała procedura zajmie 5 minut na grupę 5 myszy. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej świadomości, aby utrzymać leżący mostek.
- Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania do obrazowania/analizy bioluminescencji.
