Napompowanie agarozy w całym płucu: metoda przygotowania płuc do obrazowania na żywo ex vivo

Streszczenie

Źródło: Van den Bijgaart R.J.E. et al., Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment, J. Vis. Exp. (2016)

Ten film opisuje metodę przygotowania płuc do obrazowania na żywo ex vivo w celu zbadania interakcji między komórkami rakowymi a komórkami zrębu, przy użyciu agarozy do inflacji. W protokole próbki opisano procedurę inflacji agarozy przed obserwacją żywych interakcji komórkowych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Przygotowanie płuc do obrazowania na żywo ex vivo

UWAGA: Staraj się pracować tak sterylnie i ostrożnie, jak to tylko możliwe, aby uniknąć niepotrzebnych problemów dla komórek odpornościowych w płucach.

1. Wstrzyknąć myszowi dootrzewnowo (i.p.) śmiertelne przedawkowanie środka znieczulającego dozwolonego przez protokół zwierzęcy zatwierdzony przez IACUC, np. 1 ml 2,5% Avertin. Poczekaj, aż mysz przestanie oddychać i całkowicie przestanie reagować na szkodliwe bodźce (szczypanie tylnej łapy).
   UWAGA: Należy unikać zwichnięcia szyjki macicy i eutanazji dwutlenkiem węgla, ponieważ może to szkodliwie wpłynąć na żywotność komórek płuc.
2. Unieruchom mysz na desce rozwarstwiającej i wysterylizuj mysz 70% etanolem.
3. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby najpierw wykonać poprzeczne nacięcie nadbrzusza przez skórę, a następnie podobne nacięcie przez otrzewną. Przytrzymaj deskę sekcyjną w pozycji pionowej i przetnij aortę zstępującą, tak aby krew gromadziła się w jamie brzusznej, a nie w jamie klatki piersiowej.
4. Wytnij mały otwór w membranie, aby uwolnić podciśnienie. Przeciąć wzdłuż 10. i 12. żebra, aby wyciąć przeponę i uzyskać wizualny dostęp do płuc.
5. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć skórę aż do tchawicy nad klatką piersiową, ale pozostaw klatkę piersiową nienaruszoną. Oddziel skórę od klatki piersiowej. Odsłoń tchawicę, usuwając otaczającą ją tkankę łączną, uważając, aby nie uszkodzić samej tchawicy (ryc. 1A).
6. Wyciąć mały otwór o średnicy około 1 mm w odsłoniętej tchawicy równolegle do pierścieni chrzęstnych, jak najbliżej krtani (ryc. 1B). Uważaj, aby nie przeciąć całkowicie tchawicy.
7. Weź igłę 20 G i delikatnie włóż igłę 4-5 mm do tchawicy bez użycia siły przeciwnej (Rysunek 1D). Koniec igły powinien być widoczny przez tchawicę (ryc. 1C). Użyj kleszczy, aby ustabilizować igłę w tchawicy. Alternatywnie można zawiązać szew wokół tchawicy, aby utrzymać igłę na miejscu.
   UWAGA: Wkładając zbyt głęboko, carina może zostać uszkodzona lub tylko jedna strona płuc może być napompowana.
8. Napełnić strzykawkę 400 μl 2% agarozy o temperaturze topnienia o temperaturze 37 °C (pobranej bezpośrednio z kąpieli o stałej temperaturze). Upewnij się, że deska preparcyjna stoi i powoli wkraplaj ciepłą agarozę przez igłę do płuc, użyj ~400 μl, aby napompować płuca.
   UWAGA: Obserwuj, jak płuca napełniają się wewnątrz klatki piersiowej. Nie należy nadmiernie napompowywać płuc, ponieważ spowoduje to pęknięcie.
9. Po napompowaniu płuc, wypełniając ~2/3 klatki piersiowej, odłącz strzykawkę i trzymaj igłę w tchawicy, aby zapobiec wyciekaniu agarozy.
10. Wlać około 50 ml PBS o temperaturze 20 °C na napełnione płuca, aby agaroza znajdująca się w płucach zestaliła się i zestaliła. Powoli wyjmij igłę i zamknij tchawicę kleszczami, aby zapobiec wyciekaniu niezestalonej agarozy.
11. Odsłoń płuca, wykonując sternotomię, a następnie wyciąć płuca. Aby wyciąć płuca, przytrzymaj tchawicę, jednocześnie całkowicie przecinając tchawicę. Delikatnie pociągnij tchawicę do góry, odetnij tkankę łączną i przełyk, jednocześnie wyciągając płuca z jamy klatki piersiowej, aż płuca zostaną oddzielone od myszy (ryc. 1E).
12. Zanurz płuca w ciepłym RPMI-1640, aby zmyć nadmiar krwi i delikatnie oddziel płaty za pomocą nożyczek i kleszczy, aby przeciąć główne oskrzela trzonu płata na wnęce (ryc. 1F).
13. Umieść płaty płaską powierzchnią w dół, aby zmaksymalizować powierzchnię obrazowania, w studzience 24-dołkowej płytki obrazowej (ryc. 1G). Dodaj 100 μl RPMI-1640 o temperaturze 37 °C na wierzch płatów. Umieść kilka okrągłych szkiełek mikroskopowych o średnicy 15 mm na górze płatów, aby zapobiec ich unoszeniu się.
14. Wlej ciepły PBS do otaczających studzienek, aby zapobiec parowaniu mediów RPMI-1640. Włożyć 24-dołkową płytkę do komory klimatycznej ze zrównoważonym klimatem i utrzymywać płatki płuc w temperaturze 37 °C z powietrzem i 5% CO₂ . Umieścić komorę klimatyczną na stoliku mikroskopu konfokalnego.
    UWAGA: Można również rozważyć inne mieszaniny gazów (np. 5%_O2, 5% CO₂ w N₂ w celu zbadania zachowania komórek w warunkach niedotlenienia/niższej zawartości tlenu).

Wyniki

Rysunek 1. Protokół przygotowania płuc do obrazowania na żywo.(A) Odsłonięcie tchawicy po przygotowaniu myszy. (B) Mały wycinek wykonany w odsłoniętej tchawicy równolegle do pierścieni chrzęstnych. (C) Igła 20 G wprowadzona 4-5 mm do tchawicy. (D) Wkroplenie do płuc 400 μl 2% agarozy o niskiej temperaturze to...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Znieczulenia	nie	nie	Znieczulenie zatwierdzone przez IACUC, stosowane do znieczulenia i/lub eutanezji
PBS, sterylne USP	Amresco INC	Zobacz materiał K813-500ML	Ultra czysty gatunek do iniekcji dożylnej
1X PBS	Zakład hodowli komórkowych UCSF	nie
Platforma styropianowa	nie	nie	Będzie używany jako deska do rozwarstwiania
Cienkie nożyczki ostre	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 14060-11
Igła 20 G x 1, krótki skos	Bd	305178
Kleszcze	Sklep chirurgiczny Roboz	Złącze RS-5135
1 ml strzykawka bez igły	Bd	309659
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Lonza	Numer katalogowy: 50111	Aby przygotować 10 ml roztworu, odważ 0,2 g agarozy, dodaj do 10 ml 1 x PBS i podgrzej do rozpuszczenia. Agaroza zestala się w temperaturze pokojowej, więc trzymaj w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż zostanie użyta do nadmuchiwania.
RPMI-1640 pożywka bez czerwieni fenolowej	Technologie życiowe	Numer katalogowy 11835-030
24-dołkowa płytka obrazowa	E&K naukowy	EK-42892
Szkiełka szklane, 15 mm	Fisher Naukowy	22-031-144
Cyfrowy regulator CO2 i temperatury	Okolab	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
Komora klimatyczna	Okolab	nie	http://www.oko-lab.com
Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem Cell Observer	Zeiss	nie
powietrze	Uniwersytet Kalifornijski (UCSF)	nie
tlen	Uniwersytet Kalifornijski (UCSF)	nie
dwutlenek węgla	Uniwersytet Kalifornijski (UCSF)	nie

powiedział: